[发明专利]一种靶向沉默H19RNA表达的单链反义RNA及其效果检测方法

权利要求书

1. 一种靶向沉默非编码癌基因H19 RNA表达的单链反义RNA，其特征在于：其是以H19 RNA的第五外显子的部分序列作为靶位点，设计并合成的23nt, 27nt, 31nt, 35nt,39nt单链反义RNA，其5’和3’均为羟基,不带有其它化学修饰。

2.如权利要求1所述的靶向沉默非编码癌基因H19 RNA表达的单链反义RNA，其特征在于所述的单链反义RNA包括如下序列：

HO-UUUGAUGUUGGGCUGAUGAGGUC-OH; 

HO-UCUUUGAUGUUGGGCUGAUGAGGUCUG-OH; 

HO-UGUCUUUGAUGUUGGGCUGAUGAGGUCUGGU-OH; 

HO-GGUGUCUUUGAUGUUGGGCUGAUGAGGUCUGGUUC-OH; 

HO-AUGGUGUCUUUGAUGUUGGGCUGAUGAGGUCUGGUUCCU-OH。

3.权利要求1所述的单链反义RNA的效果检测方法，包括如下步骤：

 （1）sasRNA转染人类肿瘤细胞

将化学合成的sasRNA用DEPC处理水稀释为20--mol/L浓度的溶液，使用Lipofectamine2000脂质体转染试剂将sasRNA分别反式转染人类肿瘤细胞；

 Northern blot和荧光定量PCR检测H19 RNA的表达水平

（2）Trizol法提取各转染后细胞样品的总RNA， 部分总RNA用于Northern blot检测；部分总RNA用于逆转录反应合成cDNA，采用SYBR Green I荧光定量PCR方法以基因特异引物检测H19 RNA和内参β-actin mRNA的表达水平，2^-ΔΔCt方法计算H19 RNA的敲除水平；

（3）碘化丙啶染色结合流式细胞仪分析细胞周期的时相分布变化

转染48小时后用胰酶消化处理细胞制备单细胞悬液，碘化丙啶对基因组DNA进行染色，流式细胞仪分析不同处理组的细胞周期时相分布；

（4）sasRNA是否激活免疫副反应

终浓度40nmol/L的sasRNA转染肿瘤细胞，48h后收集细胞，Trizol提取总RNA，半定量RT-PCR检测干扰素系统标志基因的表达情况，内参为β-actin mRNA；

（5）sasRNA是否造成脱靶效应

选取人类基因组中与sasRNA存在相似性的4个基因，转染sasRNA，48h后收集样品，半定量RT-PCR检测这四个基因的mRNA水平，内参为β-actin mRNA。

4.根据权利要求3所述的单链反义RNA的效果检测方法，其特征在于所使用的人类肿瘤细胞包括人宫颈癌Hela细胞和人前列腺癌PC3细胞。

5.根据权利要求3所述的单链反义RNA的效果检测方法，其特征在于:SYBR Green I荧光定量PCR的方法检测H19 RNA的表达水平，所用的定量PCR引物为：H19QF, GGAAATGAATATGCTGCACTTTACAACC; H19QR, GCTGCTGTTCCGATGGTGT; 内参β-actin mRNA的定量PCR引物为：ActQF, CGTGGACATCCGCAAAGAC; ActQR, TGGAAGGTGGACAGCGAGGC。

6.根据权利要求3所述的单链反义RNA的效果检测方法，其特征在于:用Northern blot的方法检测H19 RNA的表达水平，所用特异探针的序列为：H19 RNA的探针序列为：GCTGCTGTTCCGATGGTGT；内参β-actin mRNA的杂交探针序列为：TGGAAGGTGGACAGCGAGGC。