[发明专利]一种靶向沉默H19RNA表达的单链反义RNA及其效果检测方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种沉默非编码癌基因H19 RNA表达的单链反义RNA及其效果检测方法。 

背景技术

基因沉默是指生物体内的特定基因由于各种调控因素的存在导致不能表达或表达降低的生物学现象，它不仅是生物体调节基因表达、维持正常生理活动的重要方式，同时也是对特定基因进行功能研究和注释，发掘疾病治疗药物靶点乃至实施疾病基因治疗的重要途径。目前常用的基因沉默技术主要包括三大类，第一类是反义DNA(antisense oligonucleotide，ASO)技术。反义DNA是指一段能与特定基因的mRNA以碱基互补配对的方式结合的反义寡核苷酸，能够阻止靶基因的转录或是翻译，从而下调基因表达(Ideue，T.，Hino，K.，Kitao，S.，Yokoi，T.，and Hirose，T.Efficient oligonucleotide-mediated degradation of nuclearnoncoding RNAs in mammalian cultured cells.RNA 2009，15，1578-1587.)。第二类是反义RNA(antisense RNA)技术。反义RNA是指能与特定基因的RNA序列互补配对的一段RNA分子，通过造成靶基因RNA的稳定性下降或是影响mRNA的转录或翻译而沉默基因的表达(Achenbach，T.V.，Brunner，B.，and Heermeier，K.Oligonucleotide-based knockdown technologies：antisense versus RNAinterference.Chembiochem 2003，4，928-935；Beisner，J.，Dong，M.，Taetz，S.，Nafee，N.，Griese，E.U.，Schaefer，U.，Lehr，C.M.，Klotz，U.，andMurdter，T.E.Nanoparticle mediated del ivery of 2’-O-methyl-RNA leads toefficient telomerase inhibition and telomere shortening in human lungcancer cells.Lung Cancer.，68，346-354)。第三类是RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术。RNA干扰是以21～23bp的小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)为效应分子，导引RISC复合体(RNA-induced silencing compplex)识别并切割靶分子mRNA的过程(Scherer，L.J.，and Rossi，J.J.Approaches for thesequence-specific knockdown of mRNA.Nat Biotechnol 2003，21，1457-1465.)。这三种方法各有优劣，但在实际应用中，往往面对相同的问题：(1)基因沉默的效率不高，导致靶基因的表达不能被有效抑制；(2)基因沉默的持续时间较短，导 致靶基因的表达回复较快，难以完成功能分析；(3)基因沉默的作用特异性不高，引起脱靶效应或是免疫副反应，造成对结果的误判(Lin，X.，Ruan，X.，Anderson，M.G.，McDowell，J.A.，Kroeger，P.E.，Fesik，S.W.，and Shen，Y.siRNA-mediated off-target gene silencing triggered by a 7 ntcomplementation.Nucleic Acids Res 2005，33，4527-4535；Tschuch，C.，Schulz，A.，Pscherer，A.，Werft，W.，Benner，A.，Hotz-Wagenblatt，A.，Barrionuevo，L.S.，Lichter，P.，and Mertens，D.Off-target effects of siRNA specificfor GFP.BMC Mol Biol 2008，9，60；Kleinman，M.E.，Yamada，K.，Takeda，A.，Chandrasekaran，V.，Nozaki，M.，Baffi，J.Z.，Albuquerque，R.J.，Yamasaki，S.，Itaya，M.，Pan，Y.Sequence-and target-independent angiogenesissuppression by siRNA via TLR3.Nature 2008，452，591-597.)。此外，对一个特定靶基因的mRNA来说，局部的二级结构等特性又使得不同位点呈现出不同的可接近性(accessibility)，进而造成基因沉默效果的巨大差异。因此，寻找有效的基因沉默方式和有效的靶基因作用位点，仍然是实际研究工作中面临的巨大挑战。