[发明专利]小麦TaCPK7启动子及其应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学、基因工程技术领域，具体地说，涉及一种小麦TaCPK7启动子及其应用。

背景技术

启动子是基因中重要的顺式作用元件，一般位于转录起始位点上游几十个碱基处，其核心结构包括TATA-box和CAAT-box，除核心结构外，还包含转录起始位点、组织特异表达元件和其他调控元件，如生物胁迫和非生物胁迫的诱导元件，这对研究基因的表达和功能具有重要的作用，同时受诱导的启动子能够通过诱导控制该基因在特定的时间和特定的空间表达，并发挥特定的功能。

启动子根据转录模式不同可分为三种：组成型启动子、组织或器官特异性启动子和诱导型启动子。其中诱导型启动子可根据需要在植物特定的发育阶段、组织器官或特定的生长环境下，诱导基因准确而有选择的表达。在光诱导启动子中，含有光应答元件(LREs)，受光的诱导调节而引起报告基因GUS活性比在光下低许多的光诱导启动子(Marraccini等，2003)。在高温诱导启动子中，有对高温(42℃)应答的向日葵的HaHSP17.7G4基因的高温诱导启动子(Coca等，1996)。

由于H₂O₂与抗病、抗逆等很多生物路径有关，至今还没有关于H₂O₂诱导启动子保守元件的报道。在拟南芥中，GST6基因的表达受H₂O₂诱导，其启动子中含有OBP1和OBF蛋白的结合位点，而OBP1能够特异促进OBF蛋白和GST6基因启动子的结合，对基因的表达可能起重要作用(Chen等，1996)。在烟草中，烟草nos基因的启动子受UV辐射诱导，但其诱导路径依赖于ROS(Yu等，1998)；在许多癌症细胞中，H₂O₂诱导下，转录因子Est1启动子中含有的ARE作用元件能和Nrf2蛋白结合，转录调节Est1基因的表达(Wilson等，2005)。

发明内容

本发明的目的是提供一种从小麦中分离出的小麦钙依赖性蛋白激酶基因TaCPK7启动子及其应用，该启动子是H₂O₂诱导型，是小麦中一种新的H₂O₂诱导型启动子，记为TaCPK7P。

为了实现本发明目的，本发明的一种小麦TaCPK7启动子，其具有：1)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；或2)SEQ ID No.1所示核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸且同等功能的由1)衍生的核苷酸序列。如在不改变启动子功能的情况下，将第155位的G取代为A，或是将第412位的T取代为G，或是将第335位的T缺失，或是在572增加A。

本发明还提供了从中国春小麦(Triticum aestivum L.)六倍体BAC文库中克隆得到TaCPK7P序列所用的引物，其包括上游引物5’-TGTCTTTTTTCCTGATTCGG-3’和下游引物5’-TCTGCCCAGAATGGAGGGA-3’。

本发明还提供了用于检测TaCPK7P序列的引物，其包括上游引物5’-AAGCTTGGTACCATCGTGGGGAGTGCTGAGGTC-3’和下游引物5’-CTCGAGTCTAGACTCCCGCCAACACACGAGGCT-3’。

本发明还提供上述启动子编码区的顺式作用元件，包括2个抗性响应元件(标识)；1个冷感应元件(标识)；5个ABA响应元件(____标识)；4个对干旱产生响应的调控元件(标识)，具体如图1所示。

本发明还提供了含有TaCPK7P的载体以及含有所述载体的宿主细胞。

本发明还提供了含有TaCPK7P的转化植物细胞。

本发明还提供了一种检测瞬时转化烟草的启动子TaCPK7P在H₂O₂诱导下启动下游基因表达的方法。具体步骤如下：

(1)将所获启动子的重组表达载体质粒和农杆菌GV3101感受态细胞混匀，置于冰上5min，然后置于液氮中5min，最后于28℃放置5min，加入无抗性的LB液体培养基，于28℃，200转摇床培养3～4小时，然后涂在相应抗性的平板上，用封口膜密封。置于28℃培养箱中，倒置培养2天；