[发明专利]一种链霉菌柠檬酸合酶基因及其编码蛋白

说明书

1技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及链霉菌柠檬酸合酶基因、该基因编码的蛋白以及该基因的应用。

2背景技术

柠檬酸合酶(citrate synthase，CS，EC 4.1.3.7)几乎存在于所有的生物体中，是细胞内多种代谢途径的关键限速酶及代谢变化的标志酶。CS可催化草酰乙酸和乙酰辅酶A之间的缩合反应生成柠檬酸和辅酶A。根据其在真核细胞中的定位不同，CS可分为线粒体CS(mCS)、乙醛酸循环体CS(gCS)、过氧化物酶体CS(pCS)。CS具有多种同工酶，这些同工酶参与多种生理过程，如线粒体能量代谢、种子萌发和抗逆等。近年来，由于其在农业、医学上的应用价值，CS受关注的程度日益升高。

CS的同工酶存在于不同的亚细胞结构中，参与细胞内多个重要的生理代谢途径。由于柠檬酸在植物代谢中起重要作用，近年来关于利用CS基因进行转基因植物的研究逐渐成为热点。已有研究表明植物可以通过分泌柠檬酸活化土壤中难溶性无机磷来提高土壤磷的可利用性。将CS基因导入粳稻和籼稻中，通过筛选获得转基因阳性植株，使CS在水稻植株内超表达，以加速根系大量合成和分泌柠檬酸，可培育出耐低磷胁迫的转基因水稻植株，直接用于生产。另外，CS等有机酸可与Al³⁺络合形成稳定的复合物，这些复合物对植物的毒性较低甚至是无毒的，所以提高有机酸合成酶基因的表达活性，增加有机酸的合成与分泌，有利于增强植物的抗铝毒耐性。研究发现，在紫花苜蓿中超表达CS基因，转基因苜蓿对酸性土壤以及铝毒的耐受力明显增强，植株的产量显著提高。此外，在果实的成熟过程中，有机酸的积累与CS的表达有关。在菠萝成熟过程中，果实中有机酸(主要是柠檬酸)的含量与CS活性成极显著的正相关。这可为提高水果品质提供了理论依据。CS基因能够显著改变植物生长状态，提高植物的产量以及对于一些胁迫环境的耐受力，因此具有较高的应用价值。

链霉菌(Streptomyces)是一种重要的原核生物，属于放线菌目革兰氏阳性土壤细菌。菌丝呈分枝状，好气腐生。链霉菌有“大自然最全能的抗生素生产者”的美誉。目前，医学应用的抗生素中，约有三分之二来源于链霉菌属。同时，链霉菌次级代谢物的种类繁多且功能多样，不仅有抗细菌、抗真菌、抗病毒和抗癌等作用，而且代谢物具有免疫抑制剂、降血压和抗高胆固醇的性质。因此，链霉菌是工业上获得次级代谢产物的重要来源。另外，链霉菌还可以产生多种可分解蛋白质、木质素、几丁质及纤维素的酵素，分解自然界不易被其它微生物分解的物质，如促进废弃物的分解，可以生产有机肥，解决环境污染问题并提高废弃物的价值等，工业用途十分广泛。近年来，随着有效的链霉菌表达系统的构建，链霉菌分子生物学研究发展迅速，越来越引起人们重视。

3发明内容

本发明所要解决的第一个问题是提供一个目前尚未完成全基因组测序的链霉菌——淀粉酶链霉菌柠檬酸合酶基因(SdCS)。其具有如序列表SEQ ID NO：1所示的基因序列。

本发明所要解决的第二个问题是提供上述基因所编码的蛋白质SdCS及其制备方法，其具有如序列表SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

本发明所要解决的第三个问题是提供含有淀粉酶链霉菌SdCS基因的重组质粒及其构建方法。

本发明所要解决的第四个问题是提供淀粉酶链霉菌SdCS基因在转基因植物中的应用。

4附图说明

图1淀粉酶链霉菌基因组第一次克隆PCR结果电泳图。

M：DL-2000Marker；1，2：PCR扩增产物，1563bp。

图2SdCS基因ORF保守片段电泳图。

M：DL-2000Marker；1：PCR扩增产物，1290bp。

图3His₆-SdCS融合蛋白SDS-PAGE电泳和Western blot分析图

(A)SDS-PAGE电泳(12％gel)。M：protein molecular mass marker；lane 1，纯化的SdCS融合蛋白；lane 2，pET-SdCS重组质粒转化Rosetta(DE3)菌，经IPTG诱导表达后的上清蛋白，SdCS本身分子量约为45kDa；lane 3，pET-SdCS重组质粒转化Rosetta(DE3)菌，未经IPTG诱导表达的上清蛋白；lane 4，pET-28b(+)空载质粒转化Rosetta(DE3)菌，诱导表达后的上清蛋白。