[发明专利]一种利用宇佐美曲霉生产羧肽酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生产羧肽酶的新方法，属于生物工程技术领域。具体而言是指使用宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001菌株固态发酵生产羧肽酶的新技术。

背景技术

羧肽酶(Carboxypeptidase)是一类肽链端水解酶，作用于肽链的游离羧基末端释放单个氨基酸，其在医药和食品工业领域有着广泛的应用。在医药领域，可用于重组人胰岛素的生产，肿瘤抗体导向酶的前药治疗，以及作为诊断急性胰腺炎轻重程度的血清标记等；在食品工业上，羧肽酶可作用于苦味肽，水解肽链羧基端的疏水性氨基酸，达到脱苦的目的。另外，羧肽酶还可用于多肽的氨基酸测序。羧肽酶有小麦羧肽酶、动物羧肽酶和微生物羧肽酶，其中，动物来源的羧肽酶主要存在于猪和牛等的胰脏中，数量非常有限，价格昂贵，其应用因此而受到限制。而微生物来源的羧肽酶来源广泛，目前已在酵母和霉菌(Aspergillus、Penicillium)中检测到羧肽酶的存在。因此，利用微生物发酵生产羧肽酶具有广阔的应用前景。

曲霉(Aspergillus)中存在的羧肽酶主要为丝氨酸羧肽酶，主要存在液泡中，在酸性环境下，它们同时具有末端蛋白水解酶、酯酶和脱酰胺酶的活性，参与多肽和蛋白质的加工、修饰与降解等多个重要环节。亚夫尔在其发明专利(公开号CN95191058.2)中报道了编码黑曲霉羧肽酶的基因，其产生的羧肽酶存在于液泡中，可降解异源蛋白。Ichishima等人分离得到的一株黑曲霉液体发酵生产羧肽酶，酶活为360 mU/mL滤液。Krishnan等人用清酒曲培养基    固体发酵培养黑曲霉产羧肽酶酶活为60.5U/mg。Morita等人用土豆葡萄糖琼脂培养基固体发酵生产羧肽酶O，酶活为463.0mkat/kg。综上所述，羧肽酶广泛存在于曲霉中，但目前无论是液态发酵或固态发酵，微生物产羧肽酶活力均较低，导致了羧肽酶的生产和应用成本高，从而限制了该酶的广泛应用。

羧肽酶属于次级代谢产物，霉菌的次级代谢产物通常是在霉菌进行分化时形成的，液态培养抑制真菌分化，所以真菌固态发酵单位体积的酶产量往往比液态发酵高。羧肽酶的产生量受碳源氮源及无机离子影响，通过改变发酵过程中的培养基组分可逐步提高产酶量。本专利中利用宇佐美曲霉E001菌株固态发酵生产羧肽酶为丝氨酸羧肽酶，可用作氨基酸测序，食品工业的脱苦剂等，其固态发酵产量最高可达5321.6U/g麸曲。微生物固态发酵具有设备简单、投入少、见效快、生产成本低以及对环境友好等优势。本发明利用宇佐美曲霉固态发酵生产羧肽酶的酶活性高于国内水平。

发明内容

本发明的目的是提供一种以麸皮、玉米粉和豆饼粉等农副产品为发酵基料，利用宇佐美曲霉E001固态发酵生产羧肽酶的方法。本发明所述固态发酵的技术方案和内容如下：

1、菌株：宇佐美曲霉(Aspergillus niger)E001，由江南大学筛选和保藏。该菌种已经于2008年在《生物加工过程杂志》杂志的Vol.6 No.2 Pg.38公开。

2、斜面种子培养；去皮马铃薯200g/L，蔗糖20g/L，琼脂20g/L，自然pH；121℃灭菌20min，放置斜面；冷却后接种E001菌株，30℃培养96h。此斜面培养基可用于菌种的活化、保藏和斜面种子等。每3个月转接1次。

3、麸曲种子的制备：250mL三角瓶中装10g基料(即麸皮10g)，(NH₄)₂SO₄0.1g，自来水12mL，自然pH，充分混匀。121℃灭菌40min，冷却后接种E001试管斜面种子，30℃培养96h，期间分别于20h和44h各翻曲一次。

4、固态发酵：250mL三角瓶中装10g基料(麸皮8～10g，豆饼粉1～2g，玉米粉0～1g)，(NH₄)₂SO₄50～100mg，MgSO₄5～10mg，CaCl₂5～10mg，KH₂PO₄30～50mg，自来水12～15mL，自然pH。121℃灭菌40min，冷却后接种E001斜面种子，30℃培养84～96h，期间分别于20～24h和44～48h各翻曲一次。

5、粗酶液提取：固态发酵结束后取培养物1g，每个锥形瓶中加入100mL50mM柠檬酸钠缓冲液(pH5.0)，碾磨10min，静置一段时间后过滤，离心(4℃、4000rpm、10min)后得到的上清液即为粗酶液。测定时经缓冲液稀释适当倍数。