[发明专利]用于人多潜能干(hPS)细胞的生长和分化的3D培养系统

说明书

技术领域

本发明涉及3D培养系统的用途，其用于从人多潜能干细胞(human pluripotent stem cells，hPS)衍生肝细胞样细胞。特别地，本发明涉及人多潜能干细胞在3D中空纤维毛细管生物反应器中至肝细胞样细胞的定向分化和成熟。

发明背景

为了在再生医学和应用研究例如药物筛选或毒理学测试中开发和实现基于干细胞的应用，需要大量具有良好确定的特征的细胞。因此，需要允许hPS以高得率和纯度定向、可重现地分化至成熟肝细胞样细胞的培养系统。

发明描述

本发明涉及用于获得肝细胞样细胞的方法，所述方法包括

i)在生物反应器中接种hPS或肝前体细胞

ii)用一种或多种培养基灌注生物反应器，进行10至50天的时间段，以获得肝细胞样细胞。

在本发明的一个方面，本发明涉及肝组织样3D结构，其包含通过用于获得肝细胞样细胞的方法获得的肝细胞样细胞，所述方法包括

i)在生物反应器中接种hPS或肝前体细胞

ii)用一种或多种培养基灌注生物反应器，进行10至50天的时间段，以获得肝细胞样细胞。

在本发明的其他方面，本发明涉及通过用于获得肝细胞样细胞的方法获得的细胞用于治疗目的，药物发现，药物配制，毒性测试或再生医学的用途，所述方法包括

i)在生物反应器中接种hPS或肝前体细胞

ii)用一种或多种培养基灌注生物反应器，进行10至50天的时间段，以获得肝细胞样细胞。

在其他实施方案中，本发明涉及生物反应器用于使hPS细胞或肝前体细胞向肝细胞命运分化的用途。

引言

当前，使用聚集体(aggregate)或微载体进行分化的3D悬浮培养模型法受到中央物质交换(central mass exchange)的限制。通过在更大的细胞群中提供基于灌注的动态培养条件(其具有连续的培养基交换和在可控气体张力下的分散充氧(decentral oxygenation))，3D灌注4区室毛细管膜生物反应器技术使得能够利用两种培养理念的有利方面。此外，适合用于优质生产规范(GMP)条件的分化方案在封闭系统中的应用是可能的。所述技术允许进行改变，并且可控的培养基参数和系统参数包括例如氧张力、气体系数应用、培养基因子梯度或对细胞产生的物理刺激例如流动和压力。

hPS细胞在生物反应器中的培养

为了在再生医学和应用研究(例如药物筛选或毒理学测试)中开发和实现基于干细胞的应用，需要大量具有良好确定的特征的细胞。因此，需要允许未分化的人胚胎干细胞以高得率和纯度定向、可重现地分化至成熟肝细胞的培养系统。

最常使用的培养和分化方法通常利用塑料培养皿形式的2D培养系统，其代表具有不连续培养基更换的静态开放系统，这导致培养环境的周期性改变，表现为培养氧基更换之间培养基中代谢产物的积累和营养物的减少。此外，此类2D培养是劳动密集型的，因为它们需要大量人工干预，从而使得更大细胞数量的操作不现实。

hPS细胞在生物反应器中的分化

由Soto-Gutierrez等人进行的hESC的肝分化研究显示，更复杂的环境(使用复合基质结构或与非实质细胞共培养)支持hESC的肝分化(Soto-Gutierrez等人，2006)。Levenberg等人显示，在用ES细胞或EB接种的PLGA-聚(乳酸-乙醇酸)共聚物和PLLA-聚(L-乳酸)的生物可降解的支架中，通过用激活蛋白A和IGF进行处理，可能诱导肝组织样结构(Levenberg等人，2003)。Baharvand等人报导了hESC在3D胶原支架中的增强的肝分化(Baharvand等人，2006)。因此，提供3D培养环境的灌注式生物反应器的使用可提供更有效且可扩展的用于胚胎干细胞分化的方法。

新型方法是利用中空纤维生物反应器进行胚胎干细胞的扩增和分化。中空纤维毛细管膜生物反应器技术使得能够实现动态灌注培养条件并且允许增加细胞密度，正如干细胞在天然组织中的那样。此外，按比例放大以用于更大的细胞群是可能的。然而，典型的两区室生物反应器装置(例如，FiberCell Duet，FiberCell systems，Inc.，www.fibercellsystems.com)(其具有围绕一束周围毛细管的细胞区室，营养物主要通过扩散供应并且使用外部充氧)受限于不均匀的物质交换(沿着数分米的毛细管长度，存在底物梯度间隔)。