[发明专利]愈创木酚产生菌的检测方法及检测试剂盒

说明书

关联的申请

本申请要求基于日本专利申请2009-142242(2009年6月15日申请)及日本专利申请2009-222796(2009年9月28日申请)的优先权，将其内容作为参照引入本说明书中。

技术领域

本发明涉及果汁原料中的愈创木酚产生菌的检测方法及检测试剂盒。

背景技术

已知在用作果汁饮料和果汁加工食品的原料的果汁中，可能含有即使在通常的酸性饮料或食品的加热杀菌条件下也能生存的耐热性嗜酸菌(TAB)。在代表性耐热性嗜酸菌即Alicyclobacillus属的细菌中，已知Alicyclobacillus acidoterrestris(AAT)及Alicyclobacillus acidiphilus(AAP)为愈创木酚产生菌(以下称作愈创木酚产生菌)。特别是有报道指出AAT菌经由香草醛及香草酸产生愈创木酚(果汁协会报2005年12月号，p.1-15；非专利文献2)。愈创木酚虽没有毒性，但具有异臭，所以产品中含有愈创木酚产生菌时，饮料的风味显著恶化。特别是原料果汁中的AAT经常被视为问题。因此，检查原料果汁和果汁饮料产品中的愈创木酚产生菌的存在，在原料及产品的品质管理中非常重要。

作为AAT的检测方法，已知下述方法：在添加有香草醛的液体培养基中添加果汁饮料进行培养，利用感官检查确认愈创木酚的臭气的方法(日本特开平7-123998；专利文献1)；在香草酸的存在下培养含有试样的培养液，进一步通过使用过氧化物酶法的处理使生成的愈创木酚显色，通过定性或使用特别装置的分光定量分析确认愈创木酚产生菌的存在的方法(日本特开2004-201668；专利文献2)；使用对于愈创木酚生成酶基因特异性的引物，通过PCR检测的方法(日本特开2003-000259；专利文献3)等。

目前广泛使用的AAT的检测方法基于上述专利文献2的技术，是一种过氧化物酶法，即，在含有香草酸的液体培养基中培养试样，检测所生成的愈创木酚，由此间接地辨别有无AAT。

但是，在过氧化物酶法中，为了在液体培养基中使AAT增殖，需要适当的预培养，因此操作变得烦杂，需要花费时间来得到结果。例如，为了定量地检测试样的AAT，首先在平板培养基中形成菌落，选择多个菌落，将各个菌落进一步在液体培养基中培养，这是烦杂的操作且需要4～6天的时间。

进而，使用过氧化物酶法辨别有无AAT时，在过氧化物酶的作用下使愈创木酚转化为四愈创木酚，染成棕色，由此进行辨别，因此，在试样为接近该色调的橙汁等的原料或培养基时，难以辨别。由于颜色也受到原料的不同批量和培养基的高压灭菌器条件等的影响，所以为了通过目视进行比色判定，需要判定者相当熟练。另外，为了正确的判定，对每个试样及每个培养基制作标准曲线的基础上，需要用分光光度计进行分析、或用GC-MS进行分析，因此还需要昂贵的分析仪器和烦杂的操作。

另一方面，作为使用固体培养基的方法已知有30℃培养法，其原理是根据培养温度进行愈创木酚产生菌和愈创木酚非产生菌的分选。例如，在低于AAT的生长最佳温度(40～50℃)的30℃下进行培养，确认菌落的有无。但是，由于在30℃培养时AAT的生长也下降，所以不仅AAT的检测灵敏度下降，而且有时也检测出生长温度区域低的对象外的愈创木酚非产生菌。因此，进行30℃培养法时，进行预培养，提高AAT的检测灵敏度，此时，所有步骤需要花费8～10天的时间，并且选择性也不能说很充分。进而，由于进行预培养，所以存在不能得到定量性的问题。

进而，已知柑橘类的水果和葡萄中含有的多酚类等成分抑制AAT的增殖。因此，检查100％果汁等果汁浓度高的原料时，需要适当稀释试样进行试验。例如，如果为橙汁时稀释至1％进行试验，但需要根据果汁的种类和产地研究稀释率，这使上述各试验的操作更加复杂。

因此，人们谋求一种不需要复杂的操作、昂贵的仪器或操作者的熟练度、且能在短时间内正确判断原料果汁中是否存在愈创木酚产生菌的方法。还需要在果实生产地和果汁原料制造设施中也能检查的简便方法。

本说明书中引用的参考文献如下所述。下述文献中记载的内容全部作为参照引入本说明书中。

专利文献1：日本特开平7-123998

专利文献2：日本特开2004-201668

专利文献3：日本特开2003-000259

非专利文献1：“耐热性嗜酸菌统一检查法手册”，社团法人日本果汁协会，2005年P.25