[发明专利]一种产丙酮酸的酿酒酵母基因工程菌及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种产丙酮酸的酿酒酵母基因工程菌及其构建方法和应用，属于遗传工程领域。

背景技术

S.cerevisiae中丙酮酸脱氢酶旁路代谢具有重要的生理作用，包括：1)促进NAD+的再生，维持胞内氧化还原平衡；2)合成胞质乙酰辅酶A，为合成细胞组成成分和氨基酸代谢提供前体；3)产生乙醇。但是，乙醇的产生导致大量碳代谢流及NAD+等辅因子损失，导致S.cerevisiae不能在胞内大量积聚丙酮酸。丙酮酸脱氢酶系代谢旁路的关键酶有丙酮酸脱羧酶(pyruvate decarboxylase)和乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase)。目前，围绕上述两个关键酶，减少或消除乙醇积累的策略包括：1)缺失乙醇脱氢酶；2)缺失丙酮酸脱羧酶；3)同时弱化丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶。

此外，在好氧的条件下，通过过量表达外源的NADH氧化酶减弱溢流代谢，也可显著减少通往乙醇的代谢通量。而硫胺素作为丙酮酸脱羧酶和丙酮酸脱氢酶的重要辅因子，在调控丙酮酸代谢方面发挥着重要的作用。将培养基中硫胺素浓度控制于亚适量的水平，可显著降低丙酮酸脱羧酶的活性，进而减少流向乙醇的碳代谢通量。在硫胺素合成代谢中，THI2编码的蛋白Thi2p，对于硫胺素的合成代谢起着重要的调控作用。本发明通过敲除THI2，干扰硫胺素的合成代谢，从而降低丙酮酸代谢关键酶(丙酮酸脱羧酶)的酶活性，进而减少通向乙醇的碳代谢流，最终促进丙酮酸的积累，为将通往乙醇的碳代谢流转向丙酮酸提供了一种新的策略和技术手段。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是构建一种能积累丙酮酸的酿酒酵母工程菌，通过降低丙酮酸脱羧酶的活性，将碳代谢流由乙醇转向丙酮酸。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案为：

通过敲除硫胺素合成途径的调控基因THI2，从而干扰硫胺素的合成，进而调控丙酮酸脱羧酶的活性，通过代谢改造，得到可积累丙酮酸的酿酒酵母基因工程菌。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种利用所述工程菌发酵生产丙酮酸的方法。将30℃、200rpm下培养12h的基因工程菌种子以5％的接种量转入发酵培养基于30℃、200rpm条件下培养96h，因S.cerevisiae CEN.PK2-1C(ΔTHI2)为缺陷型菌株，培养基需添加不同浓度的Leu、Trp、Ura、His。

丙酮酸的测定方法：

高效液相(HPLC)检测法，色谱柱为ZORBAX SB-Aq柱，流动相为磷酸缓冲盐：磷酸二氢钾8.34g，磷酸氢二钾0.87g，乙腈5ml，加水定容到1000mL，用磷酸调节pH至2.5。流速为1ml min-1，温度为35℃，检测器选用Agilent 1200DAD检测器，检测波长为210nm。

所用培养基：

种子培养基：yeast extract-peptone-dextrose(YPD)medium培养基，装液量为20ml/250ml，115oC灭菌20min。

发酵培养基(g liter-1)：glucose 60，NH4Cl 7，KH2PO45，MgSO4·7H2O 0.8，CaCO3 40，trace element 10ml，pH＝5.0，115oC灭菌20min，装液量为50ml/250ml，VB1 0.04μM单独灭菌，另外添加。

本发明提供的基因工程菌可积累丙酮酸，其浓度可达到6.77±0.14g/L，为代谢工程进一步改造酿酒酵母生产C4二羧酸的研究奠定了基础。本基因工程菌的构建方法简单，便于使用，具有很好的应用前景。

附图说明

图1：质粒pUG27及敲除盒

A：质粒pUG27结构示意图

B：敲除盒M：10000 bp DNA marker；1敲除盒(大小为1544bp)

图2：THI2敲除后，原菌S.cerevisiae CEN.PK2-1C及突变菌S.cerevisiae CEN.PK2-1C(ΔTHI2)的发酵过程曲线

A：乙醇；B：丙酮酸

图3：硫胺素(VB1)浓度对突变株S.cerevisiae CEN.PK2-1C(ΔTHI2)发酵的影响

A：丙酮酸；B：乙醇

具体实施方式

以下通过实施例来进一步阐明本发明，下列实施例用于说明目的而非用于限制本发明范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，基本上都按照常见的分子克隆手册所述的条件进行操作。

实施例1产丙酮酸的酿酒酵母工程菌

一种产丙酮酸的酿酒酵母工程菌，硫胺素合成途径中的调控基因THI2被敲除。