[发明专利]猪瘟抗体PPA-ELISA检测试剂盒及制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种猪瘟抗原重组E2蛋白的制备方法及用这种重组蛋白制备猪瘟抗体PPA-ELISA检测试剂盒的方法。 

背景技术

猪瘟(Classical swine fever，CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)引起猪的一种高度接触性、致死性的传染病，临床上主要以稽留高热、皮肤和粘膜出现大量出血点为主要特征。猪瘟具有高度传染性，主要通过呼吸道和消化道传染，不分季节，传播速度快，发病率和死亡率高，流行广泛，给养猪业造成了巨大的经济损失，是严重危害我国养猪业的最重要的疫病之一。世界动物卫生组织将其列为A类传染病，我国也将其列为一类传染病。 

猪瘟病毒E2囊膜蛋白参与病毒对细胞的感染过程，携带有能刺激机体产生保护性免疫的抗原决定簇，是CSFV的主要保护性抗原蛋白，可诱导动物机体产生保护性的中和抗体。因此，E2被作为CSFV特异性抗原研究的首选蛋白。 

目前，猪瘟的诊断方法主要包括病毒的分离与鉴定、血清学方法及分子生物学检测方法。其中，血清学检测方法是检测CSFV血清抗体重要手段之一，在CSFV的早期检测、流行病学调查和监测等方面有着重要的作用，也是免疫猪群抗体水平监测的主要方法。ELISA诊断方法具有敏感性和特异性强、操作简单、检测快速、重复性好、高通量、无辐射、价格低廉等特点，在病毒学、免疫学、血清学、寄生虫学、细菌学等领域得到了广泛的应用，是当前动物传染病检疫、流行病学调查和免疫监测广泛采用的血清学诊断技术。但目前ELISA检测所用的抗原为细胞培养的病毒，猪瘟病毒在细胞培养上浓度低，导致该法生产的猪瘟抗原产量有限，成本较高，难以满足国内猪瘟诊断和免疫检测的需要。 

发明内容

本发明提供一种制备猪瘟抗原重组蛋白的方法，同时提供利用这种猪瘟抗原重组蛋白作为包被抗原研制猪瘟抗体PPA-ELISA检测试剂盒的方法。 

本发明的猪瘟抗原重组蛋白的制备方法是参照已发表的猪瘟病毒C株基因组序列，利用Oligo6.0和DNAstar生物学软件对E2基因的抗原区进行分析，选取了E2基因的包含A、B、C、D共4个中和抗原区在内的基因片段，设计了一对扩增E2基因片段的引物，并引入酶切位点扩增去掉E2基因的跨膜区及疏水区后550bp的目的基因片段。将扩增的E2基因片段克隆到pMD18-T载体上，鉴定正确后，将目的片段进一步定向克隆到PGEX-6P-1原核表达载体，转化BL21表达菌。取转化菌培养，用IPTG诱导，获得了以包涵体形式表达的重组蛋白。重组蛋白纯化后，经免疫印迹检测证明具有良好的抗原性和特异性。 

本发明的猪瘟抗体PPA-ELISA检测试剂盒的制备方法是利用前述重组猪瘟抗原重组蛋白为包被抗原，以辣根过氧化物酶标记葡萄球菌A蛋白(SPA)为二抗，经过间接ELISA反应条件的优化，建立检测猪瘟病毒抗体的间接ELISA方法，并组装检测猪瘟抗体的PPA-ELISA试剂盒。通过与正向间接血凝试验盒(IHA)和IDEXXELISA试剂盒的比较对本发明的猪瘟抗体PPA-ELISA检测试剂盒进行评价。 

本发明的优越性包括以下方面： 

本发明中所用的抗原为基因工程方法表达出的重组抗原，具有很强的特异性，能真实准确地反应猪群中猪瘟的抗体水平。 

本发明中所用的表达载体为PGEX-6p-1高效原核表达载体，该表达载体具有GST标签，易于融合表达后重组蛋白的分离纯化。 

本发明中所用的表达菌株为大肠杆菌BL21(DE3)pLysS，表达性能稳定，且具有成本低廉，操作简单，易于培养，生产周期短等优点。 

本发明中用重组抗原(包含E2蛋白A、B、C、D共4个中和抗原区)作为试剂盒的包被抗原，比已有的用纯化的猪瘟全病毒做为包被抗原，具有易于制备、成分均一的优点，适合于规模化生产制备。 

本发明中试剂盒所用酶标二抗为辣根过氧化物酶标记葡萄球菌A蛋白(SPA)，SPA不仅与猪的血清IgG的Fc段有很强的结合力，同时还能与血清中少量的IgM和IgA结合，使本试剂盒很高的敏感性。 

本发明中试剂盒所用酶标二抗SPA与用辣根过氧化物酶标记IgG作为二抗相比，具有制备容易、性质稳定、易纯化、与抗原结合力强、易于被辣根过氧化物酶标记等优点，有助于提高试剂盒的保存期和利于其规模化组装生产。