[发明专利]一种贝类凝集素基因及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种贝类凝集素基因及其应用。

背景技术

马氏珠母贝(Pinctada martensii) 又称合浦珠母贝，是中国及世界上海水珍珠培育的最主要贝类之一，广泛分布于热带、亚热带的太平洋和印度洋沿岸。其中在中国主要分布在广东、广西、海南和台湾沿海。在中国，自从1965 年马氏珠母贝人工育苗成功地推广以来，海水珍珠养殖的面积不断扩大，产量逐年增加，海水珍珠已成为我国重要的出口产品。以其培育的珍珠被称为“南珠”，闻名于国内外。但是由于长期的人工养殖和繁育，育珠贝变小，死亡率增加，马氏珠母贝种质已呈现明显退化现象、珍珠的产量和质量都明显下降。研究其先天性免疫机制将有助于其疾病防治和增加珍珠产量。

贝类属于无脊椎动物软体动物门, 其种类多达115000，是动物界的第二大门,  也是世界上最重要经济类群之一。在贝类中，免疫包括体液免疫和细胞介导的免疫。这二者协同作用，共同抵御微生物对机体的入侵。血细胞通过受体介导的包吞作用和各种细胞毒性反应（例如释放溶酶体酶、抗菌肽、经由呼吸爆发而产生的活性氧）杀伤入侵微生物。参与贝类细胞免疫的受体主要包括两大类：一类是细胞表面受体，例如血细胞膜上的凝集素；另一类是具有调理作用的调理素，例如血清凝集素。目前在马氏珠母贝中分离的凝集素还极为有限，因此有必要分离更多的相关因子，以更深入的了解其抗病机理。

发明内容

本发明的目的在于根据现有技术中存在的上述不足，提供一种贝类凝集素基因。

本发明另一目的在于提供上述贝类凝集素基因在体外的重组表达方法。

本发明还有一个目的在于提供上述贝类凝集素基因在介导细胞凝集中的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：

本发明所述的HMG基因（贝类凝集素基因）是从马氏珠母贝抑制性差减杂交文库中筛选出来的。在随机挑选并测序的2000个克隆中，共检测到该基因的一个克隆。该基因cDNA全长819bp，其cDNA序列如SEQ ID NO:1所示；自41bp至523bp区段为其开放阅读框，编码173个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；5’非编码区长40bp，3’非编码区长296bp， 有多聚腺苷酸加尾信号（AATAAA）和多聚腺苷酸尾巴。

一种表达载体，含有上述的贝类凝集素基因。

本发明所述贝类凝集素基因编码的蛋白的表达过程中，使用的表达载体为pMAL-c2X，使用的细胞系为BL21(DE3)。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明使用实时定量PCR技术分析了马氏珠母贝HMG mRNA在血细胞、消化腺、腮、外套膜、心脏、闭壳肌、性腺组织中的表达水平。结果表明HMG在血细胞、消化腺、腮中有高水平的表达，在性腺和外套膜中有中度表达，在心脏和闭壳肌中几乎无表达。当病原体入侵机体后，机体会产生免疫应答反应，与免疫相关的基因的表达会产生明显的变化。运用实时定量PCR技术检测了马氏珠母贝在受弧菌刺激后，其血细胞中的HMG的表达水平的变化。结果表明，在受弧菌刺激后48小时，血细胞中的HMG mRNA达到最高水平（P<0.05），之后表达水平逐渐下降，在刺激后72h恢复到正常水平。

使用原核表达方法制备该基因的重组蛋白，用于研究该基因在介导血细胞凝集和细菌凝集方面的作用。

附图说明

图1为实时定量PCR检测HMG mRNA在不同组织中的分布；血细胞：haemocytes；消化腺：hepatopancreas；心：heart；腮：gill；外套膜：mantle；性腺：gonad；闭壳肌：adductor muscle。结果表明HMG在血细胞、消化腺、腮中有高水平的表达，在性腺和外套膜中有中度表达，在心脏和闭壳肌中几乎无表达；

图2为弧菌刺激后，血细胞中HMG的表达模式；星号（*）指示与0h对照组之间有显著性差异；

图3为纯化的HMG重组蛋白；Lane1：蛋白标记；Lane 2：重组表达的MBP-HMG；Lane3:纯化的MBP标签；箭头指示重组表达的目的蛋白MBP-HMG。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。

实施例

1. RNA提取