[发明专利]一种β-环糊精配基琼脂糖氢键吸附纯化缩宫素的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种化学合成多肽药物——缩宫素的氢键吸附色谱分离纯化方法，具体的是采用表面键合了β-环糊精配基的琼脂糖凝胶介质，利用氢键吸附色谱原理分离纯化化学合成缩宫素。

背景技术

自然界存在着数量庞大、种类繁多的生物活性肽，涉及各种毒素、激素、抗菌肽、信息素、细胞因子等，在各种生命活动中起着重要的调节作用，广泛参与分子识别、信号转导、酶活调节、免疫调节、细胞分化及个体发育调控等过程。自从上世纪初多肽人工合成技术发明以来，已经有几十种人工合成多肽药物上市，并被广大患者采用。随着近年来频频爆发食品、药品安全问题，以及人们对药品质量和使用安全性意识的提高，多肽药物生产的纯度标准与质量控制又重新受到各有关方面的重视。

缩宫素(oxytocin，OT)于1895年被发现，结构如图1所示，是具有一个二硫键的九肽酰胺，又名催产素，是一种哺乳动物激素，主要由下丘脑视上核和室旁核的神经分泌大细胞系统分泌产生，从垂体后叶释放入血液，沿血液循环到达远端的器官发挥作用，在临床上被广泛用于引产、催产及预防因分娩后子宫乏力引起的大出血，是目前美国FDA唯一认可用于临床引产的药物。其分子量1007.2Da，分子式C₄₃H₆₆N₁₂O₁₂S₂，等电点7.7，易溶于水，溶于丙酮、丁醇和稀醋酸，不溶于乙醚和石油醚，干品稳定，pH3.8～4.4的酸性溶液中较稳定，碱性溶液中不稳定。早年药用缩宫素的生产采用从动物垂体后叶组织中提取的方式，存在病毒灭活、除过敏原、除热原等安全性问题，且提取物中存在难分离结构近似物，即后叶加压素。我国自1969年第一次合成缩宫素以来，国内30余家缩宫素制剂生产厂家均采用九肽酰胺经钠-液氨法消除、缩合的办法合成缩宫素，最终产品的纯化过程较复杂，产品纯度低、收率低，这也是导致临床出现部分不良反应的因素之一。化学合成缩宫素粗品中的主要杂质，是一些与目标多肽结构类似的杂肽，例如氨基酸消旋化产生的非对映异构体、部分氨基酸未连接上产生的缺失肽、肽键断裂产生的断裂肽，以及氧化不彻底产生的还原态开环肽等。

人工合成多肽药物的传统纯化方法是多步反相色谱纯化，反相色谱法是目前分辨率最高的多肽纯化方法，可以精确分辨一个氨基酸残基的差异，因此除了作为纯化方法外，还经常被用作最终的纯度验证步骤。尽管已有商品化的制备级反相色谱柱，但将反相色谱技术应用于多肽药物的规模化生产还有不足：第一，反相高效液相色谱的样品载量较低，尤其是对杂质较多的粗品，过量粗制样品会造成色谱柱的不可逆塌陷；第二，介质品种有限，不易放大；第三，介质的重复使用次数有限，对样品的预处理要求较高；第四，常规硅胶基质键合烷基配基，这样的色谱分离介质，用作临床用药的生产，其生物相容性与生物安全性没有葡聚糖、琼脂糖类的介质高。

琼脂糖凝胶介质是天然多糖类色谱介质，发明于20世纪60年代，具有理想介质的许多特性：高孔度(90-96％)，即使在高浓度下也能保持高的孔度；具有连接纤维的开放的结构；高的连通性有效保证了分子内物质传递；大比表面积提供了很高的吸附能力；易制备成不同琼脂糖浓度、不同尺寸的球形颗粒以满足不同领域的需求；在氢氧化钠中稳定可满足苛刻的在位清洗步骤；低的非特异性吸附使应用面较广；具有弹性及非脆性(较易实现色谱柱的再装填)，又可通过适度的交联步骤使介质具有刚性(有较高的耐压性能)；表面具有大量亲水羟基，可被不同功能配基取代而应用于多种吸附色谱技术。

β-环糊精是一种具有桶状结构的多糖分子，结构如图2所示，内部具有疏水空腔，外表面具有丰富的亲水羟基和醚键，能够提供氢键形成位点，主要作为药物载体，与药物分子形成包合物，目的是增加药物分子的亲水性，改善药物分子在循环系统中的溶解度与释放速率。β-环糊精分子本身还具有一定的手性选择性。

氢键吸附色谱是利用色谱介质与目标分子之间形成氢键作用的强弱实现分离的一类新型色谱分离方法，利用不带有任何配基的高浓度、高交联度琼脂糖凝胶本身作为氢键吸附色谱介质，分离纯化中药多酚类化合物或多肽的机理及应用研究已有报道。

发明内容

本发明的目的在于采用自制的可规模放大的以β-环糊精为配基的琼脂糖凝胶氢键吸附色谱介质，分离纯化化学合成缩宫素粗品，简化纯化工艺，提高目标物选择性、产品回收率、产品纯度和生物安全性，提高样品载量和介质重复利用度。本方法适用于液相合成或固相合成的化学合成缩宫素粗品。本发明的目的是通过如下技术方案实现的：