[发明专利]人鼠嵌合型CD4质粒及其多抗在抑制HIV感染中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种嵌合型质粒，具体地说是人鼠嵌合型CD4质粒，以及由该质粒制备得到的多抗。

发明背景

近20年来，HIV-1疫苗领域研究结果显示，通过对HIV-1，SIV和SHIV的研究强烈显示T细胞介导的细胞免疫和B细胞介导的体液免疫两者缺一不可。抗体可以保护机体免受病毒(如麻疹病毒，肝炎病毒和流感病毒等)感染，但是，对于像HIV-1这样的高度变异的病毒来说，很难通过免疫获得具有广谱中和活性的抗体。HIV-1中和抗体靶点主要是病毒膜蛋白三聚体和易感靶细胞表面受体，以阻止HIV-1病毒感染靶细胞。尽管HIV-1通过膜蛋白突变、糖基化位点的掩盖、蛋白之间的相互作用，以及重要功能区的构象掩盖等方法逃避宿主免疫系统，但是仍然有6个广谱中和抗体通过识别HIV-1膜蛋白相对保守区而产生。与HIV-1膜蛋白高度变异相比较，细胞受体CD4及其辅助受体高度保守的特性将成为临床实验中治疗型抗体的重要靶点，成为HIV-1进入细胞的关键。有报道表明，CCR5抑制剂maraviroc仅阻止R5嗜性HIV-1感染靶细胞，对X4和双嗜性的病毒无效。而针对CXCR4为靶点的抗体研究则更加困难。在近期HIV疫苗研究过程中，关于CD4单克隆抗体研究表明其具有较强的中和多亚型病毒株的能力。CD4mAb ibalizumab(即TNX-355和Hu5A8)是人源化IgG4单克隆抗体，在临床I期和II期实验中显示其抗病毒活性。本文通过构建人CD4及人与鼠嵌合型质粒DNA免疫小鼠，通过多抗血清及单克隆抗体抗病毒能力的筛选，获得具有广谱中和能力的单抗。希望为将来的预防性和治疗性疫苗提供更多的理论及实验基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种人鼠嵌合型CD4质粒。

本发明的第二目的在于提供利用上述质粒制备得到的对HIV假病毒具有明显抑制效果的多克隆抗体。

本发明的再一目的在于提供所述多克隆抗体的用途。

本发明的发明思路为：HIV感染靶细胞首先通过与其表面CD4受体和辅助受体结合，因此如果能够阻断HIV与CD4受体的结合，则能有效地抑制HIV感染，我们设计了针对人CD4受体V1V2区域的人鼠嵌合型质粒，通过DNA免疫希望能够获得具有抑制HIV功能的多克隆抗体，为探索HIV疫苗和药物研发新靶点提供理论和实验依据。

本发明采用如下具体技术方案：

一种人鼠嵌合型CD4质粒，所述质粒的序列如SEQ ID No.8所示。

上述质粒在制备介导HIV病毒感染药物中的应用。

上述的人鼠嵌合型CD4质粒的制备方法，所述方法包括如下步骤：

(1)分别从Ghost细胞和小鼠脾细胞提取总RNA；

(2)利用P1、P2扩增人总RNA得到人CD4，P3、P4扩增鼠总RNA得到鼠CD4；

(3)P3、P10扩增鼠CD4得到鼠CD4信号肽；P11、P7扩增人CD4得到人CD4V1V2区序列；利用P3、P7扩增鼠CD4信号肽及人CD4V1V2区获得鼠CD4信号肽与人CD4V1V2区嵌合产物；

(4)将步骤(3)获得的产物经三轮PCR扩增最终得到人鼠嵌合型CD4质粒；第一轮PCR扩增引物为P3、P8，第二轮PCR扩增引物为P9、P4，第三轮PCR扩增引物为P3、P4。

所述步骤(3)中PCR条件为：94℃5min；94℃30s、55℃退火40s，72℃延伸1min，20个循环；72℃延伸8分钟。

所述步骤(4)中PCR条件为：94℃5min；94℃40s、55℃退火50s，72℃延伸90s，25个循环；72℃延伸8分钟。

一种人鼠嵌合型CD4多克隆抗体的制备方法，所述方法包括下述步骤：使用上述的人鼠嵌合型CD4质粒DNA免疫4周龄BALB/C小鼠，分别在第1、21、35、49天小鼠双后肢肌肉注射100μL 1mg/mL权利要求1所述的质粒DNA，5mm宽双电极针60V电刺激注射部位，每次电刺激持续50-ms，共6次，免疫后10天收小鼠血清。

上述的方法制备得到的人鼠嵌合型CD4多克隆抗体。

上述的多克隆抗体在制备抑制HIV假病毒药物中的用途。

一种真核表达载体，其是利用上述的质粒与载体pcDNA3.1/V5-His-TOPO构建而成的。

本发明的有益效果：