[发明专利]对多种皮肤细胞修复具持续作用的重组人血清白蛋白/FGF融合蛋白

说明书

技术领域

本发明是中国发明专利ZL200710057571.9的分案申请，也是中国发明专利ZL021428816和ZL2004100428148的继续申请。本发明涉及基因重组及表达的人血清白蛋白融合蛋白及其制备方法，并涉及单一融合蛋白或不同融合蛋白组合使用的方法。特别涉及利用酵母菌表达生产由人血清白蛋白与人细胞生长因子所形成的融合蛋白(HSA/GF)。细胞生长因子包括：表皮细胞生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板源性生长因子(PDGF)、角质细胞生长因子(KGF)和类胰岛素生长因子(IGF)等。 

背景技术

人血清白蛋白(HSA)是一种可溶性单体蛋白质，构成血液中蛋白总量的一半。白蛋白作为一种基本载体，携带传递脂肪酸、类固醇和激素分子等，其稳定的惰性性质是维持血压的一个重要因素。血清白蛋白是一种球状非糖基化的、分子量为65千道尔顿、具有585个氨基酸的血清蛋白质。这一蛋白(白蛋白前体)再通过高尔基体的转化加工，去除引导多肽，而分泌到细胞外。血清白蛋白有35个半胱氨酸，在血液中，白蛋白是一个有17个二硫键的单体(参见Brown JR，“白蛋白的结构、功能和应用”Pergamon，纽约，1977)。当没有分泌多肽时，在酵母细胞内的白蛋白产物是错配状态，将失去90％的抗原性(与血浆中自然状态白蛋白相比)，并且形成不溶性的白蛋白聚合体，不具有白蛋白的生物活性。现在用于临床的白蛋白均是从人血浆中提取的。利用微生物重组表达白蛋白(rHSA)的生产已在专利EP330451、EP361991和中国专利申请CN2004010057313.7中公开。 

白蛋白是血液中的主要成分，在人体内含量为每升血液含40克，其半衰期寿命为14-20天。综上所述，治疗性蛋白质与白蛋白形成融合蛋白后，融合蛋白将具有极大的优势使之可抵御生物体内酶解作用，并可使治疗性蛋白质在体内体外的寿命大大提高，还可以较高剂量使用。 

人源或重组人血清白蛋白在美容产品中的使用也获得了十分有意义的实际应用，并在专利CN01810411.8中有具体的描述。 

在药物制剂组成中，白蛋白也常被用作药物的稳定剂，尤其是生物药。 

利用基因工程技术，将人血清白蛋白与治疗性蛋白质基因融合在酵母菌中表达为融合蛋白，可增加治疗性蛋白质在血清中和储存时的稳定性，和较长的半衰期，达到蛋白药物的长效化。该项蛋白药物体内修饰公共技术平台，在于在林、富岩中国授权专利ZL02142881.6和ZL200410042814.8中已公开，在此引为参考文献。 

发明内容

本发明者通过动物和细胞的体内体外实验证明了人血清白蛋白与细胞生长因子形成的融合蛋白可刺激细胞增生，并具有比单体的细胞生长因子在体内和体外停留更长的时间(长半衰期和持续性)，细胞和动物实验还发现融合蛋白具有与治疗性蛋白单体相同的摩尔生物活性。当复合使用由HSA和不同生长因子形成的融合蛋白(HSA/GF)的组合时，可具有同时刺激多种皮肤细胞的修复和具协同增效作用，而适用于美容、创伤和疾病的治疗，由此完成了本发明。 

本发明所涉及的细胞生长因子(GF)包括但不局限于，表皮细胞生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、角质细胞生长因子(KGF-2)和类胰岛素细胞生长因子(IGF)。下面就其特性分别简述如下： 

①表皮细胞生长因子(Epidiuen cell Growth Factor，EGF)：是EGF是人体分泌的由五十三个氨基酸所组成的具有生物活性的蛋白质，它广泛分布在血液、唾液、尿液等体液中。它具有广泛的生物学活性，能促进表皮细胞的分裂，加速细胞的新陈代谢，使新生的表皮细胞迅速替代老化的细胞(Carpenter，实验细胞研究，164：1-10，1986)。 

②角质细胞生长因子(Keratinocyte Growth Factor，KGF，KGF-2)：有多种角质细胞生长因子存在在动物体中。以KGF-2(也叫FGF10)是一种由208个氨基酸组成的碱性蛋白，来源于胚胎上皮细胞、新生或成年间质成纤维细胞的KGF。KGF-2具有促进上皮细胞有丝分裂的作用。能通过吸引成纤维细胞和结缔组织向伤口处移行，促进损伤上皮的修复，表现为温和的促细胞再生作用(Rubin JS等，美国国家科学院院报86：802-806，1989；CN00809802.6)。