[发明专利]一种三维细胞培养支架及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物组织工程领域，特别涉及一种应用于三维细胞培养支架的制备方法和应用。本发明以纳米磷酸三钙为初始原料，通过聚甲基丙烯酸甲酯模板合成多孔磷酸钙支架。将磷酸钙支架浸入酸性海藻酸钠溶液中形成磷酸三钙/海藻酸钠薄膜的复合物，最终制备了三维细胞培养支架。

背景技术

二维(2D)细胞培养是一种制备、观察细胞、并于体外研究细胞与药物、生物因子和生物材料相互作用的技术。但是，它与细胞在体内的生长方式并不相仿。在动物体内，细胞是三维(3D)生长并构建形成活组织或器官。因此，细胞三维培养与二维培养相比，更加相似于动物体内的细胞微环境。有报道指出，通过体外的三维细胞培养，我们可以了解组织在正常和病理的组织条件下的结构-功能。因此，三维细胞培养支架具有很高的应用价值。

传统的三维细胞培养支架制备中采用的是有机聚合支架，如明胶-戊二醛，但其受制备工艺限制往往采用特定有机成分，成形机器复杂或强度低，不便作为产品。

发明内容

因此，本发明的目的在于克服上述制备工艺的不足，提供一种新型的三维细胞培养支架。

本发明的另一个目的是提供所述三维细胞培养支架的制备方法，该制备过程简便易行。并提供上述三维细胞培养支架在制备细胞培养装置中的应用。

用于实现上述目的的技术方案如下：

一方面，本发明提供一种用于细胞培养的三维细胞培养支架，其包含多孔磷酸钙支架和包被于多孔磷酸钙支架上的海藻酸钠层，所述多孔磷酸钙支架设有均匀分布的微孔。

另一方面，本发明提供上述三维细胞培养支架的制备方法，该制备方法包括以下步骤：

步骤1：固相磷酸钙含量为50～55％(重量体积比)的料浆的配制；

步骤2：聚甲基丙烯酸甲酯微球的制备；

步骤3：多孔磷酸钙支架的制备；

步骤4：将步骤3制备的多孔磷酸钙支架放入质量百分含量为4～7％的海藻酸钠盐酸溶液中，真空浸泡1-2h，用超纯水反复洗涤三次，即得。

优选地，在步骤1中，所述磷酸钙为纳米磷酸钙。

优选地，在步骤1中，所述料浆的配制包括以下步骤：

步骤1.1：纳米磷酸三钙粉末的配制；

步骤1.2：将纳米磷酸三钙粉末、分散剂及超纯水球磨0.5-2h，即得。

优选地，所述纳米磷酸三钙粉末的配制包括以下步骤：

步骤1.1.1：将硝酸钙、磷酸氢二胺和尿素溶于超纯水中，优选地，所述超纯水溶液中各原料的浓度为：硝酸钙0.5-0.6摩尔/L、磷酸氢二胺0.4-0.5摩尔/L和尿素0.56-0.6摩尔/L；

步骤1.1.2：将步骤1.1.1制得的溶液放置于烘箱中，于70-80℃干燥3-7h；

步骤1.1.3：将干燥后的物质放于马弗炉中，于700-800℃温度，煅烧1-2h，得到白色的纳米磷酸三钙粉末。

优选地，在步骤2中，所述聚甲基丙烯酸甲酯微球的制备包括以下步骤：

步骤2.1：用质量分数为5-6％氢氧化钠溶液缓慢清洗甲基丙烯酸甲酯两次，再用无水氯化钙干燥洗涤后的甲基丙烯酸甲酯12-24h，优选地，用25mL质量分数为5-6％氢氧化钠溶液缓慢清洗甲基丙烯酸甲酯两次；

步骤2.2：将碱式碳酸镁溶于质量百分含量为0.3％的聚乙烯醇溶液中，再加入甲基丙烯酸甲酯溶液、引发剂、二甲基丙烯酸乙二醇酯，在N₂保护下，将反应体系至于66-70℃下搅拌5-6h，搅拌速度为240-440r/min，优选地，所述碱式碳酸镁溶液的浓度为0.0142-0.015摩尔/L；优选地，所述甲基丙烯酸甲酯溶液与聚乙烯醇溶液的体积比为1∶12.5-1∶13，更为优选地，所述甲基丙烯酸甲酯溶液的密度为0.9410g/mL；优选地，所述引发剂为过氧化苯甲酰，所述过氧化苯甲酰的质量浓度为0.3％；优选地，所述二甲基丙烯酸乙二醇酯与聚乙烯醇溶液的体积比为1∶625-1∶667，更为优选地，所述二甲基丙烯酸乙二醇酯的密度为1.0151g/mL。

步骤2.3：反应结束后，用滤纸过滤粗产物除去残留溶液，并用超纯超纯水洗涤5次；

步骤2.4：在60-65℃烘箱中，真空干燥得到直径为200～300μm的聚甲基丙烯酸甲酯微球。

优选地，在步骤3中，所述多孔磷酸钙支架的制备包括以下步骤：