[发明专利]一种提高发酵法生产硫酸软骨素产量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种提高发酵法产硫酸软骨素产量的方法，属于发酵工程领域。

背景技术

硫酸软骨素(chondroitin sulfate，CS)又名康得灵，是一种糖胺聚糖类多糖，其二糖单体由葡糖醛酸(D-GlcUA)与N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)以β-1，3键相连。硫酸软骨素具有广泛的生物活性，主要用于神经性头痛、关节痛、神经痛等，作为安全有效的保健食品和药品在世界各国有广泛的应用。

目前，硫酸软骨素主要是以碱或酶提取法从动物软骨中提取生产，传统生产硫酸软骨素的方法存在原材料匮乏、不容易形成规模、收集原料的成本高、质量不稳定、纯度不好控制、提取复杂、生产造成污染等诸多问题。近几年，国外不断有文献报道发现一些菌株可发酵生产软骨素的类似物，微生物发酵生产软骨素或软骨素类似物的研究越来越受到人们的关注。发酵法成本低、污染小，成为最具经济效益和开发潜力的硫酸软骨素生产方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种提高发酵法生产硫酸软骨素产量的方法。

本发明的技术方案：使用筛选的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis BN)为生产菌株，在实验室条件下，利用单因素法和正交实验分别对种子培养基和发酵培养基进行摇瓶发酵优化。

菌种：实验室筛选的产硫酸软骨素的枯草芽孢杆菌

本发明的有益效果：利用本发明能够有效提高硫酸软骨素的产量，为硫酸软骨素的生产提供了新途径。硫酸软骨素的产量由177mg/L提高至449mg/L，提高幅度为153％，效果显著。

本发明通过提供一种利用微生物发酵生产硫酸软骨素的策略，对今后发酵法生产硫酸软骨素工业化实现具有一定的指导意义。

具体实施方式

对照实施例：本发明所用菌种为实验室筛选的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis BN)。

从斜面培养基转接菌体于基础种子培养基中，绘制枯草芽孢杆菌生长曲线，确定最佳接种时间为12h，对基础种子培养基进行发酵优化确定培养基最佳组成。从最佳种子培养基中按10％接种量接种于基础发酵培养基中，确定最佳发酵周期为32h，对发酵培养基进行优化确定发酵培养基的组成。以上培养基条件：温度37℃，摇床转速200rpm，500mL摇瓶装液量为50mL。

斜面固体培养基：大豆蛋白胨1.0％，牛肉膏0.5％，NaCl0.5％，琼脂2％，pH值7.0～7.2。

基础种子培养基：大豆蛋白胨1.0％，NaCl1％，酵母提取物0.5％。

基础发酵培养基：葡萄糖1.5％，大豆蛋白胨0.8％，酵母粉0.8％，K₂HPO₄·3H₂O 0.04％，KH₂PO₄ 0.04％。

最佳种子培养基：葡萄糖1.5％，大豆蛋白胨0.8％，酵母粉0.8％，K₂HPO₄·3H₂O 0.04％，KH₂PO₄ 0.04％。

最佳发酵培养基：葡萄糖4％，酵母粉5.5％，K₂HPO₄ 0.15％，KH₂PO₄·3H₂O 0.15％，MgSO₄·7H₂O 0.04％，MnCl₂·4H₂O 0.02％。

实施例1：发酵条件同对照例，利用单因素法和正交实验的方法对种子培养基的碳源、氮源、无机盐进行发酵优化。

发现：优化前后接种的菌龄不变，但是菌浓OD₆₀₀由初始的2.9增加到12.8，菌体浓度增加了341％。

实施例2：发酵条件同对照例，利用单因素和正交实验的方法对发酵培养基的碳源、氮源、无机盐进行发酵优化。

发现：优化后发酵周期不变，发酵液中菌体浓度由3.6g/L提高至6.7g/L发酵液中硫酸软骨素含量177mg/L提高至449mg/L，提高幅度为153％。