[发明专利]嵌合外源无关序列的核酸质控的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学方法进行微生物（病毒、细菌、支原体和真菌等）的检测领域，具体是一整套制备和合成嵌合外源无关序列DNA或RNA质控的技术方法。

背景技术

基于基于核酸的分子生物学检测方法或检测试剂盒都需要通过添加标准阳性质控样品，用以检验检测过程的有效性，但是，全部来源于检测对象的标准阳性样品的添加往往会对检测反应带来潜在的污染和判读的干扰。目前用于分子诊断试剂盒中的主要质控样品主要是具有感染活性的病毒血清，如王露楠等制备的丙型肝炎病毒标准质控：用 HCV RNA阴性血浆将阳性血浆稀释至含量约300 000拷贝数/mL,然后进行真空冷冻干燥.检测方法采用实时荧光定量聚合酶链反应方法和罗氏公司的PCR内标定量方法。该法制备的标准质控样品具有感染活性，容易导致病毒的扩散和传播。Satoshi Inoue等制备的用于炭疽杆菌分子诊断中的质控样品，在质控DNA中引入EcoRV和BamHⅠ两个酶切位点用于鉴别是否由于质控的污染而导致的假阳性扩增（Satoshi Inoue, 2004）。更为精湛的质控核酸的制备方法来自Laetitia Ninove在2011年发表的论文：使用人工合成的含有T7启动子引物、NotI酶切位点、检测引物（探针）序列和病毒基因序列的质控DNA（RNA）序列用于各类分子检测方法的外源性质控（Laetitia Ninove, 2011）。后两者的共同之处是，制备的质控样品均无感染性，但是均主要嵌合的是检测对象本身（或类似）的核酸序列和1~2个常见的酶切位点来鉴别检测结果中的假阳性和真阳性，鉴别精度低、鉴别反应复杂。

本发明通过在无关序列（质粒载体序列或人工随机序列）的两侧，通过基因克隆法或化学合成法添加待测微生物特异性引物序列，然后利用PCR克隆的办法获得嵌合无关序列的DNA质控，进一步利用体外转录技术即可获得可以作为检测试剂盒的RNA质控。本发明制备的核酸质控均含有一段和检测对象完全无关的基因序列，在后续的阳性排查中，使用一个针对无关序列的PCR反应即可鉴别检测结果中的假阳性和真阳性。在阴性对照正常的条件下，核酸质控样品的阳性扩增，指征检测反应的有效和正确。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于PCR检测的DNA质控和一种用于RT-PCR检测的RNA质控。

为了实现上述目的本发明采用如下技术方案：（1）无关序列来源及选择：包括方法Ⅰ或方法Ⅱ，当检测反应为基于产物长度时选用方法Ⅰ，当方法Ⅰ不能满足实际需要，特别是检测反应为taqman 实时定量PCR或类似中间含探针的检测反应时选用方法Ⅱ。

所述方法Ⅰ：从现有的质粒载体上选取一段DNA序列，用生物学软件分析该DNA序列的GC含量和二级构象，满足如下条件的DNA序列选用为无关序列Ⅰ：a）无关序列Ⅰ与待检测微生物的同源性低于5%，b）GC含量在45%～55%之间，c）二级结构较为简单，d）平均TM值在60℃～85℃之间。

所述方法Ⅱ：采用化学法合成一段无关序列Ⅱ，满足无关序列Ⅱ和待检测微生物无同源性。

（2）引物的设计

利用引物设计的一般原理针对步骤（1）方法Ⅰ中所述无关序列Ⅰ和待检测微生物分别设计一对无关序列Ⅰ引物和一对待检测微生物特异性引物Ⅰ，在无关序列Ⅰ引物的上游和无关序列Ⅰ引物的下游的5′端分别加入待检测微生物特异性引物Ⅰ上游和待检测微生物特异性引物Ⅰ下游，得到一对嵌合引物。

用引物设计的一般原则针对待检测微生物设计一对待检测微生物特异性引物Ⅱ和待检测微生物探针，还需要针对无关序列Ⅱ设计一对无关序列Ⅱ引物；合成一段从5′端到3′端依次是待检测微生物上游引物Ⅱ、无关序列Ⅱ、待检测微生物探针、无关序列Ⅱ、待检测微生物下游引物Ⅱ的DNA片段。

（3）PCR扩增

用步骤（2）中所述嵌合引物，PCR扩增步骤（1）方法Ⅰ所述现有的质粒载体，获得双链DNA序列产物Ⅰ：产物Ⅰ从5′端到3′端依次是待检测微生物上游引物Ⅰ、无关序列Ⅰ上游引物、无关序列Ⅰ、无关序列Ⅰ下游引物和待检测微生物下游引物Ⅰ。

用步骤（2）中所述待检测微生物特异性引物ⅡPCR扩增步骤（2）所述DNA片段，获得双链DNA序列产物Ⅱ：从5′端到3′端依次是待检测微生物上游引物序列Ⅱ、无关序列Ⅱ上游引物、无关序列Ⅱ、待检测微生物探针、无关序列Ⅱ、无关序列Ⅱ下游引物、待检测微生物下游引物Ⅱ。

（4）克隆