[发明专利]CIK细胞体外高效扩增的方法

说明书

技术领域

本发明所涉及的是一种体外高效扩增CIK细胞的方法。

背景技术

CIK细胞在骨髓净化和肿瘤过继治疗中的作用已在动物模型中得到证实，并开始进行临床应用。美国斯坦福大学医学中心骨髓移植研究实验室采用抗CD3mAb、IL-2、IFN-γ、IL-1培养正常人外周血淋巴细胞后，细胞的抗肿瘤活性比CD3激活的杀伤细胞明显增加，称为细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killer，CIK)。CIK细胞能大量地扩增，而且具有比LAK细胞更强的肿瘤杀伤活性。CIK细胞应用于临床，治疗一个病人的用量一般在10⁹-10¹¹之间，因此获得足够数量具有高肿瘤杀伤活性的效应细胞是决定CIK细胞能否应用于临床的关键。

传统的CIK细胞体外长期培养法采用静态和间歇换液的方式，常会因营养物耗竭和有毒副产物积累而限制细胞生长。培养过程中的几个关键参数如pH、代谢物浓度等得不到控制，无法保证细胞生长所需的环境要求；而间歇换液往往会使培养环境产生较大波动，从而影响细胞生长，同时间歇换液需使用较高浓度的细胞因子，由于这些细胞因子的半衰期很短，难以发挥应有的作用，造成成本增长和资源浪费。更为重要的是，传统培养方式为了获得足够数量的细胞，治疗一个病人往往需要处理上百个培养瓶或培养袋，易引起污染，影响细胞质量和稳定性，而且细胞培养环境无法实现有效检测和控制，培养过程难以优化，因此离产业化和临床要求甚远。为实现CIK细胞的大规模扩增，必须对现有的培养方式进行改良。体外实验证明，由悬浮搅拌体系培养出的CIK细胞具有与静态培养的细胞相同的细胞毒活性，而其扩增能力有所提高。

CIK细胞是通过诱导T细胞分化而来的，而刀豆素A(concanavalin A，ConA)和抗CD2mAb都具有激活T细胞，诱导T细胞增殖的作用。

ConA的亚基分子量为29600Da。氨基酸组成分析表明，除色氨酸(Trp)因水解破坏未被测出外，ConA可测出17种水解氨基酸，其中富含天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)等酸性氨基酸。紫外吸收光谱是ConA的特征光谱之一，ConA在220nm到340nm之间有一个紫外吸收峰，最大峰值在276nm左右。实验利用内源荧光方法研究了ConA在不同条件下的溶液构象变化和Trp残基微环境的构象特征。研究表明，ConA在天然状态下，激发波长为280nm和295nm时，其荧光发射光谱均呈现最大荧光发射峰334nm；和游离Trp最大荧光强度的波长348nm相比，蓝移了14nm，表明Trp残基位于ConA较为疏水区域。pH和变性剂脲都能使ConA的荧光强度降低，但荧光光谱的形状和荧光发射峰的位置没有明显的变化，这说明ConA的结构比较稳定。ConA能使小淋巴细胞活化，转变为淋巴母细胞，继而分裂增殖，释放淋巴因子。

CD2是分子量约49kD的糖蛋白，表达于全部人T细胞和NK细胞表面；由3种抗原性不同的分子(CD2-1，CD2-2，CD2-3)组成。CD2-1及CD2-2表达于静止细胞表面，CD2-3表达于活化的T细胞表面。应用抗CD2-2及抗CD2-3可直接活化静止的T细胞，这是成熟T细胞活化的旁路途径。CD2是粘附分子之一，在抗原递呈过程中起作用。

先前的技术使用小鼠抗人CD3单克隆抗体进行CIK细胞激活，且在静态培养方式下进行，激活环境不均一，不利于有丝分裂原与细胞充分作用，激活效率不高。由于不对有丝分裂原进行洗脱，容易造成细胞受到过度刺激而产生凋亡，从而影响CIK细胞的扩增能力和细胞毒活性，不能满足临床需要。

发明内容

本发明的目的是建立一种CIK细胞的激活以及体外扩增的方法，以克服现有技术存在的缺陷，满足临床需要。

由于ConA和抗CD2单克隆抗体这两种有丝分裂原都具有激活T细胞、诱导其大量增殖的功能，因此两者在诱导CIK细胞时可以互相补充，增强对细胞的刺激强度，达到高效扩增的目的。加之激活过程是在悬浮状态进行，在细胞被激活后对有丝分裂原及细胞因子进行洗脱，避免由于有丝分裂原与细胞长期接触导致细胞受到过度刺激而发生凋亡。凋亡会导致细胞体外扩增能力的降低，因此本技术也从抑制凋亡的角度达到了增大细胞总扩增倍数的目的。

本发明的方法包括如下步骤：

先采用常规的方法分离脐血单个核细胞，采用悬浮培养方式使用ConA和抗CD2rnAb两种有丝分裂原联合刺激，激活细胞，然后用培养基洗涤激活后的细胞，除去其中的有丝分裂原及细胞因子，再对洗涤后的细胞进行悬浮培养，即可获得CIK细胞。