[发明专利]中华绒螯蟹胚胎超低温冷冻保存方法

说明书

技术领域

本发明涉及中华绒螯蟹胚胎低温保存技术。

背景技术

中华绒螯蟹作为重要的甲壳动物经济品种，在我国水产养殖业中占据重要的经济地位。近年来，由于过度捕捞、不合理渔具运用等导致中华绒螯蟹种质资源衰退，生物多样性和遗传多样性减少，开展中华绒螯蟹胚胎的超低温冷冻保存研究对于优良种质的保护开发、资源的增殖放流以及进行商业化养殖具有重要意义。

目前对于哺乳动物和脊椎动物胚胎的超低温冷冻保存已有成功报道，但对于无脊椎动物胚胎的冷冻保存仍存在许多关键技术瓶颈，还未见甲壳动物胚胎超低温冷冻保存成功的报道。

发明内容

本发明需要解决的问题是创造一种超低温冷冻保存中华绒螯蟹胚胎的方法。

本发明的技术方案选取中华绒螯蟹前无节幼体期或原溞状幼体期的胚胎，前无节幼体期胚胎在浓度30％的1，2-丙二醇+20％二甲基甲酰胺为玻璃化液中平衡40min，然后在-20℃冰瓶中平衡1min，再在液氮口平衡1min后直接投入液氮中，前无节幼体期胚胎经过40min冷冻后，快速提至液氮口平衡1min，再快速放入38℃水浴中解冻，经0.25mol/L蔗糖洗脱10min，将前无节幼体期胚胎放在盐度15的海水中培养；或采用原溞状幼体期胚胎在浓度30％的1，2-丙二醇+20％二甲基甲酰胺为玻璃化液中平衡40min，然后在-20℃冰瓶中平衡1min，再在液氮口平衡1min后直接投入液氮中，原溞状幼体期胚胎经过35min冷冻后，快速提至液氮口平衡1min后，再快速放入38℃水浴中解冻，经0.25mol/L蔗糖洗脱10min，再将原溞状幼体期胚胎放在盐度15的海水中培养。

本发明的突出特点是创造了一种甲壳动物胚胎超低温冷冻保存的方法，首次成功保存了中华绒螯蟹胚胎，并获得了出膜幼体，达到国际领先。

具体实施方式

本发明通过在中华绒螯蟹繁殖季节，采集中华绒螯蟹抱卵蟹，从抱卵蟹上小心剥离受精卵，分别取5个不同时期的胚胎(细胞分裂期、囊胚期、原肠期、前无节幼体期和原溞状幼体期)作为研究对象，将这5个时期的胚胎分别放入三种不同浓度(10％、15％、20％)的4种抗冻剂(二甲亚砜、甲醇、1，2-丙二醇、二甲基甲酰胺)中平衡30min后，观察胚胎成活率，确立了中华绒螯蟹适宜保存的胚胎发育时期为前无节幼体期和原溞状幼体期，筛选出了适宜保存的抗冻剂为1，2-丙二醇和二甲基甲酰胺，在此研究基础上，对4种单因子抗冻剂按照一定浓度进行组合，形成6种玻璃化液，将不同时期胚胎放入6种玻璃化液中分别按照二步平衡法、三步平衡法和五步平衡法平衡40min，其中(1)二步法，用盐度15的海水将玻璃化液稀释成1/2的浓度，每个时期的胚胎在1/2浓度和玻璃化液中分别平衡20min；(2)三步法，用盐度15的海水将玻璃化液分别稀释成1/4和1/2的浓度，每个时期的胚胎在1/4、1/2浓度和玻璃化液中各平衡约13min；(3)五步法，用盐度15的海水将玻璃化液分别稀释成1/4、1/3、1/2和2/3的浓度，每个时期的胚胎在各稀释浓度和玻璃化液中逐次平衡8min。

胚胎经不同方法平衡后观察成活率情况，确立30％1，2-丙二醇+20％二甲基甲酰胺为最佳玻璃化液配方，五步平衡法为最佳平衡方法。将前无节幼体期胚胎在该玻璃化液中采用五步法平衡40min，然后在-20℃冰瓶中平衡1min，再在液氮口平衡1min后直接投入液氮中，经过40min冷冻后，将胚胎快速提至液氮口平衡1min后，再快速放入38℃水浴中解冻，经0.25mol/L蔗糖洗脱10min，将胚胎放在盐度15的海水中培养，胚胎成活率为9.3±2.5％；将原溞状幼体期胚胎在上述玻璃化液中采用五步法平衡40min，然后在-20℃冰瓶中平衡1min，再在液氮口平衡1min后直接投入液氮中，经过35min冷冻后，将胚胎快速提至液氮口平衡1min后，再快速放入38℃水浴中解冻，经0.25mol/L蔗糖洗脱10min，将胚胎放在盐度15的海水中培养，胚胎成活率为11.3±3.6％，培养至第7天，胚胎完全孵化出膜。