[发明专利]游离前列腺特异抗原与总前列腺特异抗原一体化酶联免疫检测试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及酶联免疫法检测血清前列腺特异抗原，具体是一种游离前列腺特异抗原与总前列腺特异抗原一体化酶联免疫检测试剂盒及制备方法。 

背景技术

前列腺特异抗原(prostate specific antigen，PSA)作为一种重要的生物学标志物用于，前列腺癌(prostate cancer，PCa)患者的早期筛查、治疗效果评估。但是，由于一些良性前列腺组织增生也表现为血清PSA升高，即血清总PSA水平变化并不能清晰辨别是前列腺的良性增生还是前列腺癌存在的可能。而采用血清游离PSA(f-PSA)与总PSA(t-PSA)比值(F/T，正常值＞0.16)筛查前列腺癌(PCa)，可提高筛查的准确性。F/T值在诊断灰区(t-PSA 4.0～10.0ng/ml)可很好地区分前列腺癌与良性前列腺增生。因此，同时测定游离PSA和总PSA并计算其比值(f-PSA/t-PSA)具有更重要的临床诊断价值，。 

前列腺特异抗原具有良好的免疫原性，能制备特异性抗体并通过免疫化学方法测定。游离PSA和总PSA抗原特异性不同，可通过不同单克隆抗体识别与检测。酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)具有操作简便、对实验室条件要求不高、成本低等优点，适合在基层医院开展或高危人群批量测定。血清总PSA采用双抗体夹心测定，筛选两种针对总PSA不同抗原表位的单克隆抗体，分别包被微孔板和标记辣根过氧化物酶。测定时如标本中含有前列腺特异抗原，将被包被抗体捕获并与酶标抗体结合，形成包被抗体-前列腺特异抗原-酶标抗体的复合物。未结合的物质通过洗涤去除，再加入显色底物并显色，通过测量光密度的变化来判断标本中前列腺特异抗原的浓度。血清游离PSA测定方法与总PSA相同，只是采用针对游离PSA的捕获抗体和酶标抗体。 

生物素(biotin，B)分子量为244.31，为双环结构，I环为咪唑酮环，是与亲和素(或链霉亲和素)结合的部位；II为噻吩环，含一个戊酸侧链，其末端羧基可与生物大分子连接，形成生物素标记抗原、抗体、酶等。链霉亲合素(streptavidin，SA)，分子量为65KD，由四条相同的肽链组成，一个链霉亲合素分子能结合四个生物素分子。根据生物素与链霉亲和素相结合这一特性所建立的体系称为生物素-亲和素系 统。如今生物素-亲和素系统已广泛应用于标记免疫分析技术，改善包被工艺或提高标记信号强度。 

综上所述，临床医生通常将血清总PSA水平用于前列腺癌高危人群筛查和评估疗效，f-PSA/t-PSA比值优于单独测定总PSA(t-PSA)和游离PSA(f-PSA)，进而提高临床诊断的准确性。 

但是，目前临床实验室不能直接获得f-PSA/t-PSA的比值，而是分别使用f-PSA和t-PSA两种诊断试剂盒分别测定血清中f-PSA和t-PSA水平，再计算f-PSA/t-PSA的比值。 

发明内容

本发明就是为了解决现有技术中，需要分别使用f-PSA和t-PSA两种诊断试剂盒分别测定血清中f-PSA和t-PSA水平，再计算f-PSA/t-PSA的比值的问题，而提供一种临床实验室直接获得f-PSA/t-PSA的比值的游离前列腺特异抗原与总前列腺特异抗原一体化酶联免疫检测试剂盒及检测方法。 

本发明是按照以下技术方案实现的。 

一种游离前列腺特异抗原与总前列腺特异抗原的一体化酶联免疫检测方法，其是将生物素标记抗总PSA单克隆抗体和生物素标记抗游离PSA单克隆抗体，分别加入到同一链霉亲和素包被酶标反应板的2个孔中，加入待检血清，37℃温育30分钟，弃掉反应液体，加洗涤缓冲液，静置后弃液、拍干；再加入等量酶标记PSA抗体，37℃温育30分钟，加洗涤缓冲液，去除未结合酶标记抗体、拍干；分别加入显色底物，避光反应15分钟；各孔加入终止液，终止反应，经酶标仪读取吸光度值，通过计算F孔A₄₅₀/T孔A₄₅₀获得f-PSA/t-PSA比值。 

所述游离前列腺特异抗原与总前列腺特异抗原的一体化酶联免疫检测方法，其生物素标记抗总PSA单克隆抗体和生物素标记抗游离PSA单克隆抗体是筛选出的两种单克隆抗体，分别识别游离前列腺特异抗原和总前列腺特异抗原，同时，将两种抗体分别标记生物素。 

所述游离前列腺特异抗原与总前列腺特异抗原的一体化酶联免疫检测方法，其酶标记抗体是一种同时识别总PSA和游离PSA，并与二者发生特异性结合反应的共用的多克隆抗体，将共用的多克隆抗体与辣根过氧化物酶(HRP)偶联。