[发明专利]基于离散式侧壁微电极阵列的细胞电融合芯片装置及加工工艺

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于离散式侧壁微电极阵列的细胞电融合芯片装置及其加工工艺，其主要使用范围为动物、植物、微生物细胞的融合细胞制备，同时也可应用于电穿孔、电转染等研究中，可广泛应用于遗传学、动植物远缘杂交育种、发育生物学、药物筛选、单克隆抗体制备、哺乳动物克隆等领域。

背景技术

细胞电融合技术自上世纪80年代起，因为其效率较高、操作简便、对细胞无毒害，便于观察，适于仪器应用和规范操作等优点，得到了快速发展和广泛应用（参见4326934, April 27, 1982, Pohl; 441972, April 10, 1982, Pohl; 4578168, March 25, 1986, Hofman; 4695547, Sep 22, 1987, Hillard; 4699881, Oct 13, 1987, Matschke, et al.;）。

细胞电融合可以分为两个主要阶段：细胞排队和细胞融合。

细胞排队的原理在于：生物细胞处于非均匀电场中时，被电场极化形成偶极子，该偶极子在非均匀电场作用中会受到特定的力而发生运动，即介电电泳（dielectrophoresis）。利用介电电泳可以控制细胞的运动，在细胞电融合过程中，利用介电电泳现象使细胞排列成串，压紧相互接触的细胞，完成细胞电融合过程所需的排队和融合后压紧。

细胞融合的原理在于：强电场作用会导致细胞膜穿孔，这种效应称为细胞膜电致穿孔效应（electroporation）。在细胞电融合过程中利用电致穿孔效应，使两接触的细胞膜穿孔，从而使细胞间进行膜内物质交换，使细胞质、膜融合，在一定强度的电场作用下的电穿孔是一种可逆穿孔，细胞膜会在减小或撤销电场强度时回复原状，产生细胞电融合过程的膜融合。

传统的细胞电融合系统通常都采用大型融合槽，其优点在于：（1）操作较为简便，采用大型融合槽降低了包括样品进样与出样等步骤的难度；（2）加工简便，大型融合槽的尺寸一般都在厘米量级，利用传统的机械加工手段可以较为方便地加工出所需要的融合槽结构；（3）融合量大，传统的融合槽可以容纳数毫升样品，一次实验即可获得足够的细胞进行后期筛选、培养等工作。

但传统的细胞电融合设备也存在一些缺点：（1）由于融合槽中的电极间距较大，要达到够强度的细胞排队、融合及压紧信号，需要很高的外界驱动电压，往往高达几百上千伏，对系统的电气安全性要求高，系统的成本也因此大为提高；（2）电极间的较大间距不利于对细胞的精确控制等。

为解决这一问题，研究者将细胞电融合技术与MEMS加工技术相结合。MEMS技术的加工范围通常在1 ~ 50μm，这与细胞的直径范围相当，所产生的微结构能有效控制细胞。有多家研究机构开始研究利用微流控芯片技术或者微电极阵列技术构建生物芯片来实现细胞电融合操作。

例如，美国MIT的研究人员提出了利用微流控芯片技术实现对细胞的精确控制，达到高效的细胞配对和融合（参见J. Voldman, A.M. Skelley, O. Kirak, H. Suh, R. Jaenisch, Microfluidic control of cell pairing and fusion, Nat Methods, 2009）；国内赵志强等研究人员也提出了利用MEMS技术构建微电极阵列（参见中国专利200610054121.x），通过构建微米量级间距的微电极阵列，实现在低电压条件下的细胞电融合。日本研究者提出的利用一对微电极，通过流路控制细胞的流动，使细胞运动到微电极对位置区域后，利用电场作用使两个细胞形成配对，再借助于电脉冲实现电融合（参见Daniel T Chiu，A microfluidics platform for cell fusion，Current Opinion In Biotechnology，2001）。