[发明专利]一种鉴定短尾大眼鲷的分子生物学方法

权利要求书

1.一种鉴定短尾大眼鲷的分子生物学方法，其特征在于它包括两大步骤：(1)确定短尾大眼鲷的特异引物；(2)短尾大眼鲷种类的鉴定。

步骤(1)又包括下面几个步骤：

1.1设计并筛选出一对鲈形目鱼类的核糖体5.8SrRNA和28SrRNA基因间的转录间隔子DNA片段的特异引物对作为鲈形目鱼类通用引物对，该引物对为：正向引物5′-gtcgatgaagaacgcagcta-3′，反向引物5′-gtcttctttccccgctgatt-3′；

1.2用步骤1.1得到的通用引物对，对鲈形目中常见珍稀鱼类的DNA模板样本进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

1.3将步骤1.2得到的常见珍稀鲈形目鱼类的PCR扩增产物进行克隆测序，根据测序结果选出每种常见珍稀鲈形目鱼类与其它常见珍稀鲈形目鱼类有差异的DNA片段；

1.4从步骤1.3中所选出DNA片段区域内，为短尾大眼鲷设计并筛选出一条特异引物，该特异引物为：5′-agctaaggcttacgaccctg-3′；

1.5用步骤1.1所得到的鱼类通用引物对中的一条引物与步骤1.4得到的短尾大眼鲷的特异引物配对，构成短尾大眼鲷的特异引物对；

1.6用步骤1.5所得到的短尾大眼鲷的特异引物对对鲈形目中常见珍稀鱼类的DNA模板样本进行PCR扩增；

1.7将步骤1.6所得到的PCR扩增产物在琼脂糖凝胶上进行电泳，从短尾大眼鲷的DNA模板样本中扩增得到的产物电泳后能得到显著的条带，而对其它常见珍稀鲈形目鱼类的DNA模板样本扩增产物电泳后则没有明显的条带产生，从而得到短尾大眼鲷的鉴定标准电泳条带。

步骤(2)又包括下面几个步骤：

2.1将步骤1.1中所得的通用引物对和步骤1.4中得到的短尾大眼鲷的特异引物相混合，构成混合引物；

2.2采用步骤2.1所得到的混合引物，对需要鉴别的鱼类DNA样本进行PCR扩增；

2.3将步骤2.2所得到的PCR扩增产物在琼脂糖凝胶上进行电泳，如需要鉴别的鱼类为短尾大眼鲷，则电泳结果会得到两条条带，一条是通用引物扩增产物，一条是短尾大眼鲷特异引物扩增产物；而其它鲈形目鱼类样本只有一条由通用引物对扩增产物的带，非鲈形目鱼类样本则没有电泳条带。

2.依据权利要求1中所述的一种鉴定短尾大眼鲷的分子生物学方法，其特征在于在所述步骤1.2中，对鲈形目中常见的珍稀鱼类的DNA模板分别进行PCR扩增时，鲈形目中常见的珍稀鱼类是指：短尾大眼鲷、真鲷、平鲷、黑鲷、黄鳍鲷、银鲳、卵形鲳鲹、日本金线鱼、金线鱼、花鲈、鳜鱼、大黄鱼、赤点石斑鱼、细鳞三梭鱼、尖吻鲈、发光鲷、长尾大眼鲷、军曹鱼、蓝圆鲹、乌鲳、短体银鲈等。

3.依据权利要求1中所述的一种鉴定短尾大眼鲷的分子生物学方法，其特征在于步骤1.2、1.6和2.2中，提取鱼类样本的DNA时，可以按以下常规方法进行提取：a、取鱼类新鲜组织，如鱼的肌肉、鱼鳞、鱼鳍、鱼卵、鱼血、鱼类粘液等，置于1.5ml的离心管消化过夜，用酚-氯法提取DNA；b、鱼类烘干或晒干制品，鱼类罐头制品，可以直接取样，同新鲜组织一样提取DNA；c、对于用95％酒精保存的鱼类组织样本，需用双蒸水浸泡过夜，再用酚-氯法提取DNA。

4.依据权利要求1中所述的一种鉴定短尾大眼鲷的分子生物学方法，其特征在于在步骤1.2、1.6和2.2中，对鱼类DNA样本进行PCR扩增时，PCR反应体系中的各种成份及其浓度如下：DNA样本(3μl)，DDH₂0(22.0μl)，dNTP(200μM)，10×缓冲液(3.6μl)，市售Taq酶(3U)，MgCl₂(2.25mM)，其中各类引物的添加量均为40nM。整个复合扩增循环参数如下：94℃预变性6分钟，94℃变性30秒，64℃复性60秒，72℃延伸60秒，循环次数34次；72℃延伸10分钟。

5.依据权利要求1中所述的一种鉴定短尾大眼鲷的分子生物学方法，其特征在于在步骤1.7和2.3中，进行琼脂糖凝胶时，将样本扩增产物3μl、分子量马克2μl以及凝胶载样缓冲液2μl加入到10ml的2％的琼脂糖凝胶溶液(每100ml琼脂糖凝胶溶液中加入10u的11‰的溴乙淀)处理30-40分钟。