[发明专利]一种鉴定短尾大眼鲷的分子生物学方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种鉴定常见珍稀鲈形目鱼类的方法，特别涉及一种鉴定短尾大眼鲷的分子生物学方法。

背景技术

保护生物多样性，就是保护人类自己。由于水体生态环境的特殊性和大多数水产动物一直是人们捕捉的对象，鱼类生物多样性比陆生动物多样性显得更为脆弱，承受的压力更大。保护好鱼类种质资源，就是保护人类生存所必须的水产动物蛋白的生产源泉。鱼类资源是一种可更新的资源，只要利用得当，就可取之不尽，经久不衰，但如果酷捕滥捕，也可发生资源枯竭或个体变小、质量降低。捕捞并不是一个消极因素，只要捕捞合理，它可使鱼类种群产生最大的生产量，人们可获得最大持续量。全世界约有10亿人以鱼类为主要的蛋白质来源，但同农作物及畜禽类不同的是，目前，人类所消费的鱼类数量的80％以上依然来自天然捕捞产品。在全世界水产动物，如鱼类中，只有少数种类已用于养殖，极大多数种类的养殖潜力尚待评估。据初步统计，仅中国，由于工农业生产的迅猛发展以及生活水平提高后对水产品需求的剧增，水域生态系统处于持续增长的压力之下，处于濒危状态和受到严重威胁的鱼类有97种。

由于鱼类分布范围广泛，地理差异，生态环境的不同，使得各个地区的种类不同。由于人们的生活水平的提高，对鱼产品的需求猛增，于是产生了对鱼类的过渡捕捞，乱捕乱捞时有发生，再加上人们为了满足各种需要而对鱼类生态环境造成的破坏，使许多鱼种濒临灭绝。虽然我们采取了一些措施，例如每年设立禁鱼期，发布鱼类保护白皮书，但由于没有强有力的执法队伍，主要是缺乏快速、准确、经济、易于操作的鱼类鉴别方法，所以远远达不到预期目的。

目前，常用的鱼类鉴别方法主要是沿用传统的形态学鉴别法，根据鱼体各部位的形态特征，步骤繁多、操作繁琐、工作量大、专业性强。其致命的弱点是要求鱼体结构完整，各个部位特征发育完全，肉眼可以观察鉴别。这在幼小鱼体、鱼体破碎或腐败等情况下，难以进行鉴定，易于出错。近年来国内外许多实验室开始采用线粒体DNA分型、限制性长度多态性、同工酶电泳、随机引物扩增多态性(RAPD)技术进行鱼类鉴别，但这些方便普遍同样具有繁琐费时、费力、费钱，不利于操作，可重复性差，误差大等弊端。

发明内容

本发明的目的是提供一种耗费时间少、易于实验室操作、方便直观的鉴定常见珍稀鲈形目类中短尾大眼鲷的分子生物学方法。

该方法包括两大步骤：(1)确定短尾大眼鲷的特异引物；(2)短尾大眼鲷种类的鉴定。

步骤(1)又包括下面几个步骤：

1.1设计并筛选出一对鲈形目鱼类的核糖体5.8SrRNA和28SrRNA基因间的转录间隔子DNA片段的特异引物对作为鲈形目鱼类通用引物对，该引物对为：正向引物5′-gtcgatgaagaacgcagcta-3′，反向引物5′-gtcttctttccccgctgatt-3′；

1.2用步骤1.1得到的通用引物对，对鲈形目中常见珍稀鱼类的DNA模板样本进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

1.3将步骤1.2得到的常见珍稀鲈形目鱼类的PCR扩增产物进行克隆测序，根据测序结果选出每种常见珍稀鲈形目鱼类与其它常见珍稀鲈形目鱼类有差异的DNA片段；

1.4从步骤1.3中所选出DNA片段区域内，为短尾大眼鲷设计并筛选出一条特异引物，该特异引物为：5′-agctaaggcttacgaccctg-3′；

1.5用步骤1.1所得到的鱼类通用引物对中的一条引物与步骤1.4得到的短尾大眼鲷的特异引物配对，构成短尾大眼鲷的特异引物对；

1.6用步骤1.5所得到的短尾大眼鲷的特异引物对对鲈形目中常见珍稀鱼类的DNA模板样本进行PCR扩增；

1.7将步骤1.6所得到的PCR扩增产物在琼脂糖凝胶上进行电泳，从短尾大眼鲷的DNA模板样本中扩增得到的产物电泳后能得到显著的条带，而对其它常见珍稀鲈形目鱼类的DNA模板样本扩增产物电泳后则没有明显的条带产生，从而得到短尾大眼鲷的鉴定标准电泳条带。

步骤(2)又包括下面几个步骤：

2.1将步骤1.1中所得的通用引物对和步骤1.4中得到的短尾大眼鲷的特异引物相混合，构成混合引物；

2.2采用步骤2.1所得到的混合引物，对需要鉴别的鱼类DNA样本进行PCR扩增；