[发明专利]一种对生物样品进行富集和除盐净化处理的方法

说明书

技术领域

本发明属于生化分析技术领域，具体涉及一种利用图案化表面对生物样品进行一步富集和除盐净化的处理方法，这种图案化表面可以被广泛地应用于生物样品的预处理及检测。

背景技术

基质辅助激光解吸/离子化飞行时间质谱法(MALDI-TOF MS)是一种有效的软电离方法，具有很高的灵敏度，适用于蛋白质组学中生物样品的分析检测。但是，在质谱分析过程中，由于样品沉积面积的不可控制以及基质和样品不均匀的共结晶会降低质谱分析的检测灵敏度及重现性。另外，生物样品中存在的盐及其它的一些试剂也会严重地干扰样品和基质的结晶，导致质谱信号微弱甚至淬灭质谱信号。因此，利用合适的样品预处理方法来富集和除盐净化对于MALDI分析和检测是非常重要的。

一些离线方法如HPLC，ZipTipC₁₈以及一些功能化的纳米粒子都被用于预先分离复杂的生物样品。虽然样品得到纯化，但是由于其复杂的操作过程就不可避免会造成样品损失以及污染物的引进。为了克服离线方法的不足，在线样品富集及除盐的方法引起了广泛的关注。近几年，科学家利用旋涂或滴涂的方法将疏水聚合物如聚四氟乙烯、石蜡、尼龙等修饰在MALDI的样品板上(J.Mass Spectrom.2002，37，512；Anal.Chem.1997，69，4716；Anal.Biochem.2004，327，222；Anal.Chem.1998，70，750；J.Am.Soc.Mass Spectrom.1994，5，230)。在进行水洗除盐的时候由于盐与疏水聚合物的作用力很弱，盐会被溶解在水中而被除掉，但是额外的水洗步骤则会导致不可避免的样品损失，同时也不利于高通量的质谱检测。2007年，Jia首次利用大量的基质溶液推洗污染物的方法来实现免于水洗的在线样品富集及除盐(Proteomics 2007，7，2497；中国专利，公开号：CN1811407A)。但是这种方法需要大量基质溶液排盐，会导致部分分析物损失；另外，这种方法还需要严格控制样品溶液的沉积体积。

发明内容

本发明的目的是在于提供一种操作简单快速、高灵敏度、高通量的一步样品除盐和富集的新方法。具体涉及在基底(硅，玻璃，石英等)上构筑具有疏水-亲水-疏水区域结构的封闭(环形或方形)图案化表面，使多肽或蛋白样品实现简单快速地靶上在线免水洗除盐和同步富集，避免了样品的损失，并进行MALDI-TOF MS的分析和检测的新方法。

本发明提出的利用疏水-亲水-疏水区域结构的封闭图案化表面对生物样品进行在线免水洗除盐和同步富集的方法，具体的步骤如下：

1、在基底上构筑疏水-亲水-疏水区域的封闭图案化表面；

2、将1～5μL多肽或蛋白溶液滴在上述步骤制备的图案化表面上，在室温下自然晾干，从而得到干燥的样品点；在自然晾干的过程中，由于图案化表面的中央疏水区域对蛋白或多肽有很强的疏水相互作用而对无机盐等污染物的吸附很弱，从而使无机盐等污染物被大部分转移到亲水区域，而多肽或蛋白则被吸附到中央疏水区域；

3、将1～5μL、5～20mg/ml的基质溶液(溶质为芥子酸、2-氰基-4-羟基肉桂酸或2，5-二羟基苯甲酸，溶剂为乙腈与三氟乙酸水溶液等体积混合，三氟乙酸水溶液中三氟乙酸的体积分数为0.1％)滴在上述干燥的样品点上，室温下自然晾干后，在图案化表面上形成样品和基质均匀的共结晶；在此过程中，少部分残留在中央疏水区域的无机盐等污染物会重新溶解在水溶液里，从而被进一步带到亲水区域，而蛋白或多肽仍能保留在中央疏水区域；

4、无需额外的水洗除盐步骤也无需过量的基质溶液除盐，将上述步骤富集除盐后的样品直接进行MALDI-TOF MS的分析和检测。

上述方法中，步骤1中构筑的疏水-亲水-疏水区域结构的封闭图案化表面的具体方法，包括如下几个步骤：

A.选取基底，对基底进行清洁及亲水化处理；

B.在基底上构筑厚度0.2～200μm、半径250～1000μm的聚合物涂层(聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚苯乙烯(PS)或光刻胶等)；

C.以步骤B构筑的聚合物涂层为挡层，在挡层以外的基底上修饰含氟单分子层(十七氟癸基三甲氧基硅烷、十三氟辛基三甲氧基硅烷等)或蒸镀金属层(金或银)作为疏水层，其厚度为20～200nm；

D.将步骤C得到的基底浸入有机溶剂中进行超声处理除去聚合物挡层，随后用水超声除去基底上残留的有机溶剂，从而在基底上形成半径250～1000μm的空白亲水区域；