[发明专利]β-葡糖苷酶激活剂用于检测和/或鉴定难辨梭菌的用途

说明书

本发明涉及检测和/或鉴定难辨梭菌(Clostridium difficile)的方法。其还涉及对难辨梭菌具有特异性的包含β葡糖苷酶激活剂的反应培养基。

难辨梭菌(C.difficile)是革兰氏阳性芽孢杆菌，其是完全厌氧的且形成孢子。难辨梭菌是严重程度不定的肠疾病的病因：中度或爆发性腹泻、假膜性结肠炎或中毒性巨结肠，这些病症自身可以成为脓毒症的原因。难辨梭菌通过经口摄入对胃酸耐受且在肠中萌发的孢子来传染。结肠的共生菌落的失衡能使难辨梭菌增殖，这产生成为结肠炎病因的毒素。在许多情况下，共生菌落的失衡归因于服用抗生素。难辨梭菌可以被认为是无害的环境微生物，其在某些条件下变成机会致病菌。难辨梭菌的无症状消化系统携带者在成年人群中估计为3%，但在抗生素治疗或在高流行性单位停留之后达到个体的15%至25%。通常观察到高携带水平，从住院患者的20%至40%高达至幼儿的50%至70%。能够早期且迅速的诊断是预防严重并发症和有效医疗护理的关键要素。

诊断基于对毒素的寻找并基于培养。

毒素直接从粪便的分离是难辨梭菌的产毒菌株存在的优异标记。参考方法在于通过细胞培养来寻找致细胞病变作用(在英语中，CTA表示细胞毒活性)。该方法非常灵敏，但未被标准化，并且需要专门的技术人员和几天的响应时间。已经开发了ELISA型免疫酶试验，其检测单独的毒素A或者毒素A和B。获得结果的时间降低了。然而，推荐将用于检测毒素的免疫学技术与细菌培养组合以分离难辨梭菌菌株。可在由本申请人销售的难辨梭菌琼脂上采用该培养，然后通过生物化学方法（例如20A试条(gallery)或快速ID32A试条）来鉴定难辨梭菌菌落。然而，通过试条鉴定必须使要鉴定的细菌的纯培养物在合适的生长培养基上，以获得足够的生物质(3至4McFarland)，这在最好的情况下耗时48小时(从采样开始24至72小时的分离培养(这仅给出了假定的检测)，然后24至72小时的培养以产生足够的生物质)。然后，对于ID32A试条，在孵育4小时后进行试条的读数，对于20A试条，在孵育24至48小时之后进行试条的读数。

最终，可以使用分子生物技术进行诊断。然而，这些技术并非目前常用的。

通过本申请人为了改善在细菌培养物中直接鉴定难辨梭菌而进行的工作，本申请人证明，β-葡糖苷酶酶底物的使用可以容易且快速地鉴定难辨梭菌。所述β-葡糖苷酶底物的使用在申请WO2009/092982中描述为减少获得难辨梭菌鉴定结果所用的时间。

早期且迅速地鉴定在样品中可能存在的难辨梭菌仍是主要目的，并且本申请人已经通过更特别地寻求加快酶活性的显示来继续从事其工作。因此，本申请人已经出乎预料地证明，包含β-葡糖苷酶底物和通式Ar-β-D-吡喃葡糖苷的β-葡糖苷酶激活剂的反应培养基使难辨梭菌在样品中被迅速鉴定，换言之，这样的培养基使至少一些难辨梭菌菌株的酶活性被更早地检测，在所述通式中，Ar-对应于芳环或多个毗连的芳环。Ar-β-D-葡糖苷化合物的使用使β-葡糖苷酶被激活并且能观察到难辨梭菌菌落的明显更强的着色。有利地，所述Ar-β-D-葡糖苷化合物具有远优于其他β-D-葡糖苷衍生物（例如纤维二糖（4-O-β-D-吡喃葡萄糖基-D-葡萄糖）或甲基-β-D-葡萄糖）的难辨梭菌β-葡糖苷酶激活能力。

已知的是，通式Ar-β-D-葡糖苷的化合物能用作β-葡糖苷酶底物，在所述通式中，Ar表示至少一种同素环的或杂环的芳环。该用途报道于申请WO2009/092982(如上)中。同样，Hildebrand和Schroth报道了熊果苷或氢醌β-D-吡喃葡糖苷作为碳源以0.5%重量/体积(换言之，5g/l)的浓度与葡萄糖组合用于反应培养基中。由色谱方法测定的熊果苷在氢醌中的水解是丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)的β-葡糖苷酶活性的标记(Hildebrand和Schroth,Applied Microbiology,1964;12(6):487-491)。这阻碍了本领域技术人员将Ar-β-D-葡糖苷化合物作为β-葡糖苷酶激活剂用于反应培养基中以检测或鉴定难辨梭菌，因为他们会发现其自身与旨在显示靶微生物的酶活性的底物竞争。

最后，现有技术报道了口服给予的熊果苷被排泄和代谢在尿中，并且由于其利尿和抗菌性质可以加以使用(Schindler等人,2002;J.Clin.Pharmacol.;42(8):920-927;Siegers等人,2003,Phytomedicine;10(Suppl4):58-60)。这样的用途也阻碍了将熊果苷用于反应培养基中以检测细菌。