[发明专利]抗癌融合蛋白

说明书

本发明涉及治疗性融合蛋白、特别是重组融合蛋白的领域。更具体地，本发明涉及包含可溶性人TRAIL5蛋白的序列片段和免疫刺激肽的序列的融合蛋白，包含它们的药物组合物，它们在治疗、特别是抗癌试剂中的用途，以及编码所述融合蛋白的多核苷酸序列，包含所述多核苷酸序列的表达载体，以及包含这些表达载体的宿主细胞。

TRAIL蛋白属于细胞因子家族（肿瘤坏死因子相关的细胞调亡诱导性配体），也被称作Apo2L(Apo2-配体)，是肿瘤细胞和被病毒感染的细胞中的细胞调亡的强有力的激活子。TRAIL是体内天然产生的配体。TRAIL蛋白，其氨基酸序列，编码DNA序列和蛋白表达系统首次公开于EP0835305A1。

TRAIL蛋白通过与促细胞调亡TRAIL表面受体1和2（TRAIL-R1/R2）结合并随后激活这些受体来发挥其抗癌活性。这些受体，也被称作DR4和DR5（死亡受体4和死亡受体5），属于TNF受体家族并且在不同类型的癌症细胞上过表达。这些受体的激活能诱导独立于阻抑基因p53的细胞调亡的外部信号传导途径，其通过激活的胱天蛋白酶-8引起执行性胱天蛋白酶的激活，从而降解核酸。在TRAIL激活后释放的胱天蛋白酶-8也可引起Bid蛋白的释放，从而间接激活线粒体途径，Bid蛋白转位至线粒体，在那里其刺激细胞色素c的释放，因此间接扩大来自死亡受体的细胞调亡信号。

TRAIL选择性作用于肿瘤细胞，基本上不诱导健康细胞的调亡，健康细胞对该蛋白是抗性的。因此，认识到TRAIL作为抗癌试剂的巨大潜力，其作用于多种不同类型的肿瘤细胞，包括血液恶性肿瘤和实体肿瘤，同时极少影响正常细胞并显示出潜在相对小的副作用。

TRAIL蛋白是II型膜蛋白，其具有281个氨基酸的长度，在被蛋白酶切割后，它的包含氨基酸残基114-281的细胞外区域形成大小为20kDa的可溶性sTRAIL分子，其也是有生物活性的。TRAIL和sTRAIL这两种形式都能通过与存在于靶细胞上的TRAIL受体相互作用而激发细胞调亡。使用细胞系测试证明了TRAIL分子的可溶性部分的强烈的抗肿瘤活性和非常低的系统性毒性。

对于具有对应于hTRAIL的氨基酸114-281的氨基酸序列的重组人可溶性TRAIL（rhTRAIL）（在INN下称作dulanermin）的人类临床研究也显示出其良好的耐受性并且没有剂量限制性毒性。

还发现短于114-281的TRAIL片段能结合膜死亡受体并通过这些受体诱导细胞调亡，如最近就122-281hTRAIL的重组循环序列改变的突变体所报道的，例如见EP1688498。

到目前为止所报道的重组TRAIL蛋白对于肝细胞的毒性效应似乎与修饰即多聚组氨酸标签相关，而非标签化的TRAIL不显示系统性毒性。

然而，在进一步研究和开发的过程中，很多癌症细胞似乎也显示出对于TRAIL的原发性或获得性抗性（见例如WO2007/022214）。虽然对于TRAIL的抗性的机理尚未完全了解，但是相信其可在TRAIL诱导的细胞调亡途径的不同水平表现其自己，从细胞表面受体水平到信号传导途径内的执行性胱天蛋白酶。这种抗性限制了TRAIL作为抗癌试剂的有用性。

此外，在对患者进行的临床试验中证明，TRAIL作为单一治疗的实际有效性是低下的。为了克服这种低的效率和肿瘤对TRAIL的抗性，设计了与放疗和化疗试剂的多种组合治疗，其产生了协同性细胞调亡效应(WO2009/002947;A.Almasan and A.Ashkenazi,Cytokine Growth Factor Reviews14(2003)337-348;RK Srivastava,Neoplasis,Vol3,No6,2001,535-546,Soria JC et al.,J.Clin.Oncology,Vol28,No9(2010),p.1527-1533)。在WO2009/140469中描述了rhTRAIL与所选择的常规的化疗试剂(紫杉醇、卡铂)和单克隆抗-VEGF抗体组合用于癌症治疗的用途。然而，此类组合必然意味着公知的常规化疗或放疗的缺陷。