[发明专利]基于卵黄抗体的甲鱼系统性败血症球状病毒间接ELISA检测方法

权利要求书

1.一种基于卵黄抗体的甲鱼系统性败血症球状病毒间接ELISA检测方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）抗原预包被

将甲鱼系统性败血症球状病毒抗原用.01 M 的pH 为9.6的碳酸盐缓冲液稀释至0.1 ng/ul，按100ul/孔加于聚苯乙烯96孔反应板中，4℃放置过夜，次日倾去孔内液体，将孔用PBS-T洗涤液洗涤3次后，每孔加入1 % 牛血清白蛋白封闭液，37 ℃低速振荡温育1 h进行封闭，封闭结束后，吸走孔内牛血清白蛋白封闭液；

（2）检测反应

将孔用PBS-T洗涤液清洗后，加入倍比稀释的甲鱼系统性败血症球状病毒卵黄抗体100ul，每梯度设1平行，同时设立空白对照和阴性对照，加盖37 ℃温育1 h后，用PBS-T洗涤液洗3次，再在每孔中加入100ul的预先用1%牛血清白蛋白封闭液按1：10000比例稀释的辣根过氧化酶标记的羊抗鸡IgG，37 ℃温育1 h后，PBS-T洗涤液清洗5次，蒸馏水洗3次后，每孔加入新配置好的邻苯二胺底物溶液100ul，37 ℃暗处显色15 min，每孔加50ul的2M H₂SO₄终止反应；

（3）结果判定

在酶标仪上读取各孔492 nm波长处的吸光度值，测定孔吸光度值大于阴性对照孔均值2.1倍以上者判为阳性。

2.根据权利要求1所述的基于卵黄抗体的甲鱼系统性败血症球状病毒间接ELISA检测方法，其特征在于步骤（1）中所述的甲鱼系统性败血症球状病毒抗原的制备过程如下：选取患病甲鱼，取甲鱼内脏置于预先冰浴过的TNE缓冲液中，匀浆直至完全碎裂，将匀浆液在4℃，6000g条件下离心10min后，取上清液在4℃ ，8000g条件下离心20min，取再次离心所得上清液于4℃，35000g离心1.5h后获取一次沉淀物，将一次沉淀物的沉淀上层疏松部分用TM缓冲液小心冲洗掉，沉淀下层白色部分重悬于1ml的TM缓冲液中，4℃冰浴过夜；次日将过夜处理的沉淀重新悬浮起来，4℃下3500g条件下离心5min后，取上清液于4℃，38000g条件下离心1.5h获取二次沉淀物，将二次沉淀物的沉淀上层疏松部分小心去掉后，下层白色沉淀用少量TM缓冲液重悬后制成病毒悬浮液，即为甲鱼系统性败血症球状病毒抗原。

3.根据权利要求2所述的基于卵黄抗体的甲鱼系统性败血症球状病毒间接ELISA检测方法，其特征在于步骤（2）中所述的甲鱼系统性败血症球状病毒卵黄抗体的制备过程如下：

a．蛋鸡免疫并收集免疫鸡蛋

将蛋鸡进行1次基础免疫和2～3次加强免疫，所述的基础免疫为在所述的甲鱼系统性败血症球状病毒抗原中加入等量的弗氏完全佐剂，充分乳化后对蛋鸡进行注射免疫，所述的加强免疫为在所述的甲鱼系统性败血症球状病毒抗原中加入等量的弗氏不完全佐剂，充分乳化后对蛋鸡进行注射免疫，注射用量为每千克母鸡注射500mg甲鱼系统性败血症球状病毒抗原，每次免疫间隔时间为15天，完成免疫后10天，开始收集鸡蛋，于4℃冰箱保存；

   b．特异卵黄抗体的提取

将上述得到的免疫鸡蛋用酒精擦拭蛋壳并分离卵黄，吸取卵黄液，然后在卵黄液中加入卵黄液10倍体积的0.05 M的 pH 为5.0的乙酸-乙酸钠缓冲液，混匀后于4 ℃冰箱静置过夜处理，将过夜处理后的混合液于4 ℃，10000g的条件下离心20 min后取上清液，在上清液中加入饱和的（NH₄）₂SO₄使其终浓度为40%，4 ℃静置10h，再10000g离心20 min后取沉淀，将沉淀用140g/L的Na₂SO₄稀释至100 ml，再次于4℃静置10 h后，10000 g离心20 min，沉淀用0.01M 的pH 为7.2 的PBS重悬，最后用截留量为100KD的透析袋透析除盐得到甲鱼系统性败血症球状病毒卵黄抗体。

4.根据权利要求3所述的基于卵黄抗体的甲鱼系统性败血症球状病毒间接ELISA检测方法，其特征在于所述的TNE缓冲液的pH为7.5，配制终浓度如下：50 mM Tris-HCl，200 mM NaCl，5mM乙二胺四乙酸分，1mM 苯甲基磺酰氟。