[发明专利]基于卵黄抗体的甲鱼系统性败血症球状病毒间接ELISA检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物制品制备技术及应用领域，尤其是涉及一种基于卵黄抗体的甲鱼系统性败血症球状病毒间接ELISA检测方法。  

背景技术

甲鱼，学名中华鳖，历来是药膳及滋补佳品。20世纪80年代，温室养殖的兴起，使原本奉为稀珍的甲鱼的产量大幅提高，随之而起的是疾病的肆意流行。2007年以来，在浙江地区，尤以杭州、宁波地区甲鱼生态养殖场暴发一种系统性败血症，主要症状为系统性出血性败血，研究人员经流行病学调查、组织切片与超薄切片观察和人工感染试验等研究，确定一种新型球状病毒是其原发性致病因子，该新型球状病毒为甲鱼系统性败血症球状病毒（Turtle systemic sepsis spherical virus TSSSV），该病毒具有较强的传染性和高达90-100%的致死性，而且这种疾病潜伏期较长，初期表现出来的病症如白底板等容易和以往发现的一些细菌性疾病的病症相似，容易造成误诊，贻误治疗时机，因此建立一种便捷、灵敏的病毒检测方法颇为重要。 

目前，甲鱼系统性败血症球状病毒的实验室诊断方法主要为RT-PCR方法，但该方法需要进行核酸的提取等步骤，样品制备繁琐，在检测大批量样品时容易发生交叉污染。酶联免疫吸附试验（ELISA）具有操作简单、敏感性、高快速、易标准化等优点，适合于大规模的样品检测。 

鸡卵黄免疫球蛋白G抗体又称为IgY（Yolk Immunoglobulin）是存在于免疫后母鸡卵黄中的一种7S免疫球蛋白，它具有产率高、稳定性好、特异性强等优点，是一种易于生产、廉价的抗体，免疫1只鸡所收集到的仅1个鸡蛋中含有的特异性IgY的量（约200mg）远远高于免疫1只兔所收集到的全部血清中的抗体量，IgY具有较强的耐酸、耐碱、耐热能力。但是，目前国内外还没有关于基于卵黄抗体的甲鱼系统性败血症球状病毒间接ELISA检测方法的相关研究报道。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种稳定性、特异性和灵敏度高、免疫干扰小、背景低的基于卵黄抗体的甲鱼系统性败血症球状病毒间接ELISA检测方法。 

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种基于卵黄抗体的甲鱼系统性败血症球状病毒间接ELISA检测方法，包括以下步骤： 

（1）抗原预包被

将甲鱼系统性败血症球状病毒抗原用.01 M 的pH 为9.6的碳酸盐缓冲液稀释至0.1 ng/ul，按100ul/孔加于聚苯乙烯96孔反应板中，4 ℃放置过夜，次日倾去孔内液体，将孔用PBS-T洗涤液洗涤3次后，每孔加入1 % 牛血清白蛋白（BSA）封闭液，37 ℃低速振荡温育1 h进行封闭，封闭结束后，吸走孔内牛血清白蛋白封闭液；

（2）检测反应

将孔用PBS-T洗涤液清洗后，加入倍比稀释的甲鱼系统性败血症球状病毒卵黄抗体100ul，每梯度设1平行，同时设立空白对照和阴性对照，加盖37 ℃温育1 h后，用PBS-T洗涤液洗3次，再在每孔中加入100ul的预先用1%牛血清白蛋白封闭液按1：10000比例稀释的辣根过氧化酶（HRP）标记的羊抗鸡IgG，37 ℃温育1 h后，PBS-T洗涤液清洗5次，蒸馏水洗3次后，每孔加入新配置好的邻苯二胺底物溶液100ul，37 ℃暗处显色15 min，每孔加50ul的2M H₂SO₄终止反应；

（3）结果判定

在酶标仪上读取各孔492 nm波长处的吸光度值，测定孔吸光度值大于阴性对照孔均值2.1倍以上者判为阳性。

步骤（1）中所述的甲鱼系统性败血症球状病毒抗原的制备过程如下：选取患病甲鱼，取甲鱼内脏置于预先冰浴过的TNE缓冲液中，匀浆直至完全碎裂，将匀浆液在4℃，6000g条件下离心10min后，取上清液在4℃ ，8000g条件下离心20min，取再次离心所得上清液于4℃，35000g离心1.5h后获取一次沉淀物，将一次沉淀物的沉淀上层疏松部分用TM缓冲液小心冲洗掉，沉淀下层白色部分重悬于1ml的TM缓冲液中，4℃冰浴过夜；次日将过夜处理的沉淀重新悬浮起来，4℃下3500g条件下离心5min后，取上清液于4℃，38000g条件下离心1.5h获取二次沉淀物，将二次沉淀物的沉淀上层疏松部分小心去掉后，下层白色沉淀用少量TM缓冲液重悬后制成病毒悬浮液，即为甲鱼系统性败血症球状病毒抗原。 

步骤（2）中所述的甲鱼系统性败血症球状病毒卵黄抗体的制备过程如下： 

a．蛋鸡免疫并收集免疫鸡蛋