[发明专利]洋甘菊法呢基焦磷酸合酶基因克隆及原核表达

权利要求书

1.一种洋甘菊法呢基焦磷酸合酶，其特征在于：该酶的氨基酸序列如SEQ NO 2所示。

2.编码权利要求1所述洋甘菊法呢基焦磷酸合酶的基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ NO 1所示。

3.含有权利要2所述洋甘菊法呢基焦磷酸合酶基因的重组表达载体。

4.权利要求3所述重组表达载体的构建与表达方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

（1）以洋甘菊法呢基焦磷酸合酶基因单链cDNA为模板，以P1和P2为扩增引物进行PCR扩增，得PCR扩增产物；

所述引物为：

P1：5' CATGCCATGGATGAGTATCGTGGATCTGAAATCAAAGTTTT 3'

P2：5' CGGGATCCCTACTTTTGCCTCTTGTAGATTTTACCCAAG 3'；

所述扩增条件为：采用25μl反应体系，94℃预变性5min, 94℃ 30sec，55℃退火30sec,72℃延伸1min，共30个循环；

（2）将步骤(1)中所得PCR扩增产物与pMD 19-T 克隆载体16℃连接过夜，连接产物转化至 DH5α感受态菌株，37℃振荡培养一小时，取适量培养液涂布于添加 X- gal和 IPTG的LB平板进行蓝白斑筛选，挑取白斑菌落摇菌，进行序列分析，挑选序列正确的克隆提取质粒，获得含有洋甘菊法呢基焦磷酸合酶基因（下称FPS）的pMD 19-T重组质粒；

（3）用限制性内切酶NcoI和BamHI对步骤（1）pMD 19-T重组质粒进行双酶切，切胶纯化回收FPS基因片段，同样用限制性内切酶NcoI和BamHI双酶切pET-30a(+)空质粒，得到线性pET-30a(+)质粒；在PCR管中加入1.5μl克隆载体双酶切胶回收产物，6.5μl双酶切pET-30a(+)质粒，1μl 10×T4 DNA 连接酶，1μl T4 DNA 连接酶缓冲液16℃连接过夜；将得到的FPS基因与pET-30a(+)质粒连接产物转化至DH5α感受态菌株，加入LB培养基摇菌一小时，涂板于含50 μg/mL卡那霉素的LB培养基上筛选挑取单菌落，在加有50 μg/mL卡那霉素的LB培养基摇菌5-6小时，并进行菌液 PCR鉴定，提取质粒进行双酶切验证，筛选阳性重组克隆进行DNA测序；得到含有FPS基因重组质粒pET-30a(+)-FPS；

（4）提取DH5α中的重组质粒pET-30a(+)-FPS，转化至表达菌株大肠杆菌BL21(DE3),用含有50 μg/mL Kan的LB培养基培养12小时，挑取阳性克隆于5ml含有50 μg/mL Kan液体培养基中，37℃振荡培养5小时，进行PCR鉴定；同时测序。