[发明专利]洋甘菊法呢基焦磷酸合酶基因克隆及原核表达

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说是一种洋甘菊法呢基焦磷酸合酶基因克隆及原核表达与应用。

背景技术

洋甘菊(Matricaria chamomilla L.)为菊科母菊属的草本植物，全草芳香，含有挥发性芳香油。其挥发油具有消炎、抑制真菌、解痉镇静、止痛及改善肺癌病人症状等作用。其精油由于独特的香气和抗氧化作用而广泛用于食品、饮料、烟草、日化、医药等领域中。是集园林绿化、美化、香化、彩化于一身的很有市场潜力的农业产业结构调整的新品种。

洋甘菊中有效成分主要集中在挥发油中,花中挥发油含量一般在0.2%-0.8%之间,最高可达1.9%。挥发油呈暗蓝色,芳香。挥发油中主要成分有α－红没药醇、母菊薁（1，4-二甲基-7-乙基薁）等，均为倍半萜类物质。母菊薁为蓝色粘稠液体，具有显著地消炎作用，可治疗支气管哮喘、风湿病、过敏性胃炎，结肠炎湿疹等，有减轻过敏反应并有局部麻醉作用。由于母菊薁是洋甘菊精油中最具有价值的成分之一，欧洲各国常根据它在精油中的含量作为评定洋甘菊药材质量的标准。洋甘菊精油中母菊薁含量因产地、生长条件的差异而变化很大，含量通常在0-18.28%之间。

母菊薁为倍半萜类物质，生物合成途径属于植物类异戊二烯代谢途径,其中法呢基焦磷酸合酶(farnesyl pyrophosphate synthase , fps) 是异戊二烯代谢途径中一个重要的酶。它是一种异戊烯基转移酶,催化由五碳原子的异戊烯基焦磷酸( IPP) 和二甲基丙烯焦磷酸(DMAPP) 连续缩合反应,形成法呢基焦磷酸(FPP) 。FPP 是甾体、皂甙、倍半萜等许多萜类衍生物的合成前体,这些物质在植物生长发育或抗病过程中具有重要作用。 近年来, 植物如拟南芥 、白羽扇豆、青蒿 、银杏和棉花等中的FPS基因也已先后被分离克隆。但迄今为止, 国内外尚未见有关洋甘菊萜类物质代谢合成途径关键酶基因如FPS 基因等研究报道。从不同物种中克隆分析FPS 基因, 深入研究其结构特征、基因进化及其他生物学功能意义深远。

发明内容

本发明的目的是提供一种洋甘菊法呢基焦磷酸合酶（FPS）基因克隆及其原核表达，为 FPS蛋白的进一步结构和功能的研究奠定基础，已期通过对FPS基因的深入研究达到调控次生代谢产物的目的。

本发明技术方案如下：

一种洋甘菊法呢基焦磷酸合酶，该酶的氨基酸序列如SEQ NO 2所示。

一种编码上述述洋甘菊法呢基焦磷酸合酶的基因，其核苷酸序列如SEQ NO 1所示。

含有上述洋甘菊法呢基焦磷酸合酶基因的表达载体，该表达载体的构建与表达方法，具体包括如下步骤：

（1）以洋甘菊法呢基焦磷酸合酶基因单链cDNA为模板，以P1和P2为扩增引物进行PCR扩增，得PCR扩增产物；

所述引物为：

P1：5' CATGCCATGGATGAGTATCGTGGATCTGAAATCAAAGTTTT 3'

P2：5' CGGGATCCCTACTTTTGCCTCTTGTAGATTTTACCCAAG 3'；

所述扩增条件为：采用25μl反应体系，94℃预变性5min, 94℃ 30sec，55℃退火30sec,72℃延伸1min，共30个循环；

（2）将步骤(1)中所得PCR扩增产物与pMD 19-T 克隆载体16℃连接过夜，连接产物转化至 DH5α感受态菌株，37℃振荡培养一小时，取适量培养液涂布于添加 X- gal和 IPTG的LB平板进行蓝白斑筛选，挑取白斑菌落摇菌，进行序列分析，挑选序列正确的克隆提取质粒，获得含有洋甘菊法呢基焦磷酸合酶基因（下称FPS）的pMD 19-T重组质粒；