[发明专利]一种PCR步移技术及其所使用的试剂盒

权利要求书

1.一用于PCR步移技术的半随机引物，其特征在于，其从5’端至3’端的序列组成依次为：12～30个固定碱基，3～8个全简并的碱基(n)，3～7个固定碱基，n为a、g、c和t中的任一种。

2.如权利要求1所述的半随机引物，其特征在于，其序列如SEQ ID NO.3，或者如SEQ ID NO.5，或者如SEQ ID NO.7所示。

3.一种用于PCR步移技术的试剂盒，其特征在于，其包括如权利要求1所述的半随机引物。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括dNTP、PCR buffer、Mg²⁺、Taq DNA聚合酶和dd H₂O中的任一种或多种。

5.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括基因抽提试剂。

6.一种以如权利要求3～5任一项所述试剂盒进行PCR步移的方法，其特征在于，其包括如下步骤：第一轮PCR，以与待测DNA已知序列相互补的上游引物1和如权利要求1所述的半随机引物对待测DNA模板进行PCR扩增；所述上游引物1的长度为15~30bp。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的待测DNA为真核生物基因组DNA，在第一轮PCR之后还包括第二轮PCR：以与待测DNA已知序列相互补的上游引物2和如权利要求1所述的半随机引物为扩增引物，以第一轮PCR的产物为模板进行PCR扩增；所述上游引物2位于上游引物1的5’→3’方向的内侧。

8.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述第一轮PCR的PCR反应体系包括如下终浓度的各组分：0.2~3μmol/L上游引物1、0.2~3μmol/L半随机引物、0.2mmol/L dNTP、1×PCR buffer、1.5mM的Mg²⁺、0.02U/μL Taq DNA聚合酶和1～100ng/μL模板；所述第一轮PCR的PCR扩增程序为为：①92-95℃，3-6min；②94℃，30s；③50-64℃，30s；④72℃，30-180s，其中，步骤②至④的循环数为30-45；所述第二轮PCR的PCR反应体系包括如下终浓度的各组分：0.2~3μmol/L上游引物2、0.2~3μmol/L半随机引物、0.2mmol/L dNTP、1×PCR buffer、1.5mM的Mg²⁺、0.02U/μL Taq DNA聚合酶和1～50ng/μL模板；所述第二轮PCR的PCR扩增程序为：①92-95℃，3-6min；②94℃，30s；③50-64℃，30s；④72℃，30-180s，其中，步骤②至④的循环数为30-45。

9.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于，在PCR完成之后，还需要对第一轮PCR或第二轮PCR的产物进行电泳，选择清晰条带割胶纯化后，进行测序。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的待测DNA模板为原核生物基因组DNA，所述测序用的引物为所述上游引物1或所述半随机引物；或者，所述的待测DNA模板为真核生物基因组DNA，所述测序用的引物为所述上游引物2或所述半随机引物。