[发明专利]一种PCR步移技术及其所使用的试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种PCR步移技术及其所使用的试剂盒，特别涉及一种已知DNA片段侧翼未知序列的PCR步移技术及其所使用的试剂盒，可以广泛应用于遗传及分子生物学领域。

背景技术

到目前为止，绝大多数物种的基因组序列仍然未知，简便易行的基因步移技术在现代分子生物学研究中发挥着不可替代的作用。

基因步移技术主要有以下7个方面的应用:

(1)分离已知基因的侧翼序列；

(2)鉴定基因插入位点；

(3)根据基因的已知片段分离、检测目的基因；

(4)用于人工染色体片段的构建搭接；

(5)构建图位克隆中的重叠群片段；

(6)转化标记辅助育种中的STS或SCAR标记等；

(7)用于全基因组测序的间隔填补，以获得完整的全基因组序列。

基于PCR方法的染色体步移技术按原理可分为两类：一是依赖于酶切连接介导的PCR法，如：反向PCR、载体PCR、接头PCR等，二是不需要酶切连接的PCR法，如：热不对称交错PCR（TAIL-PCR）、半随机引物PCR等。尽管这些方法都有成功应用的实例，但也具有各自的缺点，大部分操作步骤复杂，程序耗时。

依赖于酶切连接介导的PCR法需要进行酶切、连接等反应，试剂要求多，操作步骤多，实验耗时，非特异性难以避免。如：反向PCR需先对基因组进行酶切，然后进行连接，需要酶切连接各种试剂，操作步骤多。反向PCR中环化反应难以控制、线状串联体成为副产物甚至是主要产物，导致非特异性扩增。连接PCR和载体PCR等,必须产生一个包括部分已知序列的酶切产物。如果已知序列没有限制酶的酶切位点或是高度重复的，应用就很困难。

不需要酶切连接的PCR法，PCR程序设计复杂，且都有低温退火循环步骤，需要多轮PCR，才能获得目标序列，序列特异性难以保证。如：TAIL-PCR设置程序复杂，需要对程序条件进行反复设置，有假阳性。专利《一种长PCR步移试剂盒及其使用方法和应用》中介绍的半随机引物PCR法，操作相对简单、获得序列长度长。但介绍的方法中用到的半随机引物多达11条，工作量大；PCR扩增中途加入试剂，必须通过二轮PCR才能得到目的片段，且PCR程序中有低温退火步骤，PCR污染较难控制，序列扩增特异性难以保证。

总之，目前所用的基因步移的方法，均存在操作繁琐、序列扩增特异性差等缺陷。因此，迫切需要探索新的简便、快速、高效的PCR步移技术。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的缺陷与不足，提供一种简便、快速、高效的PCR步移技术。

本发明的目的是通过下列技术方案来实现的。

本发明采用的技术方案之一是：一用于PCR步移技术的半随机引物，其从5’端至3’端的序列组成依次为：12～30个固定碱基，3～8个全简并的碱基(n)，3～7个固定碱基，n为a、g、c和t中的任一种。

较佳地，所述半随机引物的序列如SEQ ID NO.3，或者如SEQ ID NO.5，或者如SEQ ID NO.7所示。

本发明采用的技术方案之二是：一种用于PCR步移技术的试剂盒，其包括如上所述的半随机引物。

较佳地，所述的试剂盒中还包括dNTP、PCR buffer、Mg²⁺、Taq DNA聚合酶和dd H₂O中的任一种或多种。

更佳地，所述的试剂盒还包括基因抽提试剂。

本发明采用的技术方案之三是：一种以如上所述的试剂盒进行PCR步移的方法，其包括如下步骤：第一轮PCR，以与待测DNA已知序列相互补的上游引物1和所述的半随机引物对待测DNA模板进行PCR扩增。

较佳地，所述上游引物1的长度为15~30bp。

本发明中，所述的模板若为真核生物基因组DNA，则在第一轮PCR之后较佳地还包括第二轮PCR：以与待测DNA已知序列相互补的上游引物2和所述的半随机引物为扩增引物，以第一轮PCR的产物为模板进行PCR扩增，所述上游引物2位于上游引物1的5’→3’方向的内侧。