[发明专利]一种2-酮基-L-古龙酸高耐受型氧化葡糖酸杆菌及其在维生素C发酵生产中的应用

权利要求书

1.一种2-酮基-L-古龙酸高耐受型菌种，其特征是：所述菌种为氧化葡糖酸杆菌（Gluconobacter oxydans）TL-1045，该菌种已于2012年6月6日保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.6188。

2.一种维生素C中间体2-酮基-L-古龙酸的发酵方法，其特征是，步骤包括：以巨大芽孢杆菌为伴生菌，与权利要求1所述的氧化葡糖酸杆菌（Gluconobacter oxydans）TL-1045组成混合菌种，以L-山梨糖为原料进行混菌有氧发酵，将L-山梨糖转化为2-酮基-L-古龙酸。

3.根据权利要求2所述的发酵方法，其特征是,具体包括以下步骤：

（1）菌种的活化：将用茄瓶保存的巨大芽孢杆菌和氧化葡糖酸杆菌用活化培养基洗下，然后在活化培养基中于27-32℃下培养18-24 h，得活化的菌种液； 

（2）菌种的分离纯化：用无菌生理盐水将步骤（1）得到的活化菌种液进行梯度稀释，取10^-5-10^-7稀释液0.1 ml涂布在平板上，然后将平板在27-32℃下培养4-6天； 

（3）混菌的培养：用接种环将步骤（2）中10-25个平板上培养得到的全部氧化葡糖酸杆菌菌落挑取到0.2 ml无菌生理盐水中，制成氧化葡糖酸杆菌菌悬液；然后从步骤（2）中平板上选择巨大芽孢杆菌菌落，用接种环在巨大芽孢杆菌菌落内环和外环之间挑取针尖大小的巨大芽孢杆菌接到氧化葡糖酸杆菌菌悬液中，搅拌混匀制得混菌悬液；取混菌悬液0.05-0.1 ml接种到茄瓶培养基中，涂布均匀，27-32℃培养3-5天； 

（4）种子液的制备：将步骤（3）中茄瓶培养得到的混菌用种子培养基洗下，接种到盛有种子培养基的摇瓶中，在27-32℃、80-250 rpm的条件下培养18-24 h，得种子液，每个茄瓶接种两个摇瓶； 

（5）种子液的扩大培养：将步骤（4）得到的种子液按5-20%的接种量接种到扩大培养基中，在80-250 rpm、通气比0.3-0.8 L/L·min、27-32℃条件下培养20-30 h； 

（6）发酵培养：将步骤（5）扩大培养所得的种子液按5-20%接种量接种到发酵培养基中，在80-250 rpm、通气比为0.3-0.8 L/L·min 、27-32℃条件下培养25-40 h，发酵过程中流加碱性物质溶液控制pH始终为 6.7-7.3，L-山梨糖下降到5-15 g/L时，流加L-山梨糖保持L-山梨糖浓度为10-25 g/L。

4.根据权利要求3所述的发酵方法，其特征是：步骤（1）中活化培养基的组成为：山梨糖5-15 g/L，葡萄糖 2-5 g/L，酵母膏3-8 g/L，玉米浆3-10 g/L，尿素0.05-0.2 g/L，pH 6.7-7.2。

5.根据权利要求3所述的发酵方法，其特征是：步骤（2）中平板培养基组成为：山梨糖5-20 g/L，胰蛋白胨1-5 g/L，尿素0.05-0.2 g/L，玉米浆2-6 g/L，牛肉膏0.5-2 g/L，酵母膏0.5-2.0 g/L，磷酸二氢钾0.5-1.5 g/L，硫酸镁0.1-0.3 g/L，琼脂粉17 g/L，pH 6.7-7.2。

6.根据权利要求3所述的发酵方法，其特征是：步骤（3）中茄瓶培养基组成为：山梨糖3-8 g/L，酵母膏2-6 g/L，硫酸镁1-3 g/L，琼脂粉17 g/L，pH 6.7-7.2。

7.根据权利要求3所述的发酵方法，其特征是：步骤（4）中种子培养基的组成为：山梨糖8-20 g/L，葡萄糖1-5 g/L，玉米浆5-12 g/L，尿素0.05-0.2 g/L，pH 6.7-7.2；步骤（5）中扩大培养基组成为：山梨糖8-20 g/L，葡萄糖1-5 g/L，玉米浆5-12 g/L，尿素0.05-0.2 g/L，pH 6.7-7.2。

8.根据权利要求3所述的发酵方法，其特征是：步骤（6）中发酵培养基组成为：山梨糖20-30 g/L，玉米浆5-12 g/L，尿素0.05-0.2 g/L，pH 6.7-7.3。

9.根据权利要求3所述的发酵方法，其特征是：步骤（6）中发酵时间为32-35 h。

10.一种维生素C的制备方法，采用二步发酵法制备维生素C，其特征是：采用权利要求2-9中任一项所述的维生素C中间体2-酮基-L-古龙酸的发酵方法将L-山梨糖转化为2-酮基-L-古龙酸。