[发明专利]一种水稻光敏核不育系的分子检测方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及利用2对光敏基因引物和2种核酸内切酶检测光敏核不育系的方法及试剂盒。

背景技术

杂交水稻的推广应用已经极大地促进了全球稻米产量的增加。光敏核不育系（PGMS）是两系农作物杂交种的核心部分。利用光敏核不育系进行的杂交水稻制种已获得了非常成功的发展并得到广泛应用。因而在杂交水稻育种中不育系的鉴定是非常重要的一环。

光温条件控制水稻育性转换的分子机制的研究目前已经取得了很大的进展。大部分真核生物的基因组序列转录成了长的非编码RNA（lncRNAs）。其中长日特定雄性育性相关RNA（LDMAR）调节水稻的PSMS。在长日条件下植物正常花粉的发育需要足够数量的LDMAR的转录。野生型和突变体之间的单核苷酸多态性（SNP）改变了LDMAR的二级结构。在长日条件下，导致了发育中的花粉过早的细胞程序化死亡（PCD），从而导致PSMS。有研究表明“农垦58S”光敏不育性主要受第12染色体的一个主效基因座pms12-1控制。在正常水稻中，野生型PMS12-1的表达抑制了光敏不育的发生。PMS12-1编码了一个独特的非编码RNA，产生一个名为osa-smR5864w的21个核苷酸的小分子RNA。与正常水稻品种相比，光敏不育水稻中pms12-1发生了C-G的一个替换，该突变影响了小RNA的表达水平及其可能与靶基因的互作能力而产生雄性不育，是构成粳稻光敏核不育系的原因。

目前进行光敏核不育系鉴定的主要方法是花粉镜检法和自交结实法。其中花粉镜检法因为直观、操作简便和成本低可用于大群体鉴定而成为目前进行不育系鉴定的主要方法。但这一方法存在如下一些缺点：水稻生育期太长而受时间限制、育性划分模糊和较难判断。光敏核不育系是因为pms12-1的点突变所致，与正常水稻相比，突变体发生了C-G的一个替换，这为依据pms12-1的基因序列来鉴定光敏核不育系提供了依据。而对单碱基多态性位点的检测有赖于操作简便、结果明了的检测方法。较常见的单碱基多态性位点的检测方法包括测序、SSCP、RFLP等方法。这些方法虽各有优点，但也各有其不足之处。测序可以直接测出DNA序列中的所有突变位点的碱基替代情况，但该方法需要昂贵的仪器和较长的步骤，成本较高；SSCP方法较为成熟，但操作繁琐，耗时长，结果易造成误判；PCR-RFLP方法要求待测多态性位点和某一酶切位点相关。

发明内容

本发明的目的是为了快速准确的检测出水稻材料是否为光敏核不育系，从而提供一种光敏核不育系的分子检测方法及检测试剂盒，本发明方法可根据特异引物和核酸内切酶来鉴定光敏核不育系。

本发明的目的是通过以下方式实现的：

一种水稻光敏核不育系的分子检测方法,包括如下步骤：

a.抽提水稻叶片中基因组总DNA；

b.任选以下一对引物对提取的基因组总DNA进行PCR扩增；

GC-D1：

正向引物：GCATGCTTCACCAGCACGTCCA，

反向引物：TAGCTTGCTTCATCTTGGTATG；

GC-D2：

正向引物：CCCATATATCTTGTCCAGTGCT，

反向引物：TAGCTTGCTTCATCTTGGTATG；

c.将扩增产物用核酸内切酶进行酶切；

如用引物GC-D1扩增得到的PCR产物用核酸内切酶RsaI进行酶切；如用引物GC-D2扩增得到的PCR产物用核酸内切酶AccI进行酶切；

d.由酶切产物的带谱推出该基因的SNP如果是G，则该材料为光敏核不育系；SNP如果是C，则不是光敏核不育系。

所述的步骤d中用RsaI酶切，如果SNP是G，得到381bp、224bp和108bp3个条带；如果SNP是C，得到605bp和108bp2个条带；

用AccI酶切，如果SNP是G，无酶切产物；如果SNP是C，得到443bp和334bp2个条带。

一种水稻光敏核不育系的分子检测试剂盒，包括：

引物GC-D1：

正向引物：GCATGCTTCACCAGCACGTCCA，

反向引物：TAGCTTGCTTCATCTTGGTATG，

和核酸内切酶RsaI；

或者引物GC-D2：

正向引物：CCCATATATCTTGTCCAGTGCT，

反向引物：TAGCTTGCTTCATCTTGGTATG，