[发明专利]一种利用石英晶体微天平检测可卡因的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物传感器技术领域，具体涉及一种利用石英晶体微天平检测可卡因的方法。

背景技术

可卡因(cocaine)，别名古柯碱，是一种从古柯叶中分离出来的的生物碱。可卡因是一种强效局部麻醉剂，脂溶性高，对神经组织亲和性良好，属中枢神经兴奋剂。因其毒性大并易于成瘾，近来已被其他局部麻醉剂所取代，长期吸食可卡因身体和心理都会产生依赖性，对身体和心理造成极大伤害。可卡因的快速检测具有重要的意义。传统检测方法有高效液相色谱法、气相-质谱联用法、薄层色谱法及高效毛细管电泳法等。基于适配体的检测方法，具有高分辨率与高亲和力，弥补了现有抗体的不足。适配体（aptamer）是一类由SELEX筛选技术(指数富集的配基系统进化技术)筛选产生的寡链核酸（DNA或RNA）。适配体能特异性地结合小分子，多肽，蛋白，乃至细胞，病毒或寄生虫等配体。它们可以折叠成功能化的三维结构，并形成口袋结构，并与特定配体结合。适配体可以通过SELEX的方式从单链寡核苷酸库中体外筛选得到。这一过程已经自动化了，目前筛选周期已经从几个月缩短到几天。适配体具有以下特点：1）靶分子广，从小分子到蛋白及有机大分子到细胞层面；2）高分辨率，例如能分辨出分子结构上只有一个甲基差别的茶碱与咖啡因；3）高亲和力，筛得aptamer的解离常数可以达到nmol/L水平，甚至pmol/L水平4）可体外合成、易于修饰；5）筛选过程相对简便、经济。适配体的出现提供了一种高效识别的研究平台，展示了良好的应用前景。目前，已有可卡因适配体被筛选出来，并被应用于基于比色法（J.Am.Chem.Soc.2002,124,9678-9679.）以及基于量子点（Anal.Chem.,2009,81,3051–3055）的检测方法中。石英晶体微天平（Quartz crystal microbalance，QCM）是一种利用单结晶石英的压电电效应的称重装置，当施加一个外部电场时，会产生机械振动，当晶片厚度为电极机械振荡波半波长的奇数倍时，发生共振。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种快速，实时检测的利用石英晶体微天平检测可卡因的方法。该方法采用夹心法的方式在石英晶体微天平的表面固定可卡因的适配体，同时采用表面引发聚合的方式增大信号，能有效的节约人力，有望实现高度自动化。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种利用石英晶体微天平检测可卡因的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

步骤一、配制DNA浓度为0.2μM的DNA组装液，然后采用DNA组装液孵育清洗干净的QCM芯片，得到表面自组装DNA的QCM芯片；所述DNA为巯基修饰DNA，DNA序列（SEQ ID NO.1）为：5’-TCA CAG ATGAGT AAA AAA AAA AAA-3’；

步骤二、采用浓度为2μM的巯基聚乙二醇的乙醇溶液孵育步骤一中所述表面自组装DNA的QCM芯片使芯片表面的多余位点封闭；

步骤三、制备引发剂标记的DNA溶液；

步骤四、采用适配体DNA溶液和步骤三中所述引发剂标记的DNA溶液共同孵育步骤二中封闭后的QCM芯片，用缓冲溶液冲洗孵育后的芯片表面，得到固定有适配体DNA的QCM芯片；将所述固定有适配体DNA的QCM芯片装入石英晶体微天平的反应器中，然后向反应器中通入缓冲液，待基线平稳后，读取石英晶体微天平监测到的频率F1；所述适配体DNA的序列（SEQ ID NO.2）为ACT CAT CTG TGA ATC TCG GGA GACAAG GAT AAA TCC TTC AAT GAA GTG GGT CTC CC；所述缓冲液为0.1M pH值为7.0的PBS缓冲液；

步骤五、将步骤四中装入石英晶体微天平的反应器中的QCM芯片取出，氮气吹干后置于表面引发聚合反应液中，并将整个反应体系移至手套箱中，室温下反应2h～4h后将QCM芯片从表面引发聚合反应液中取出，用PBS溶液冲洗QCM芯片，然后用氮气吹干；

步骤六、将步骤五中吹干后的QCM芯片装入石英晶体微天平的反应器中，然后向反应器中通入缓冲液，待基线平稳后，读取石英晶体微天平监测到的频率F2，再向反应器中通入检测物，待石英晶体微天平频率变化曲线平稳后读取监测到的频率F3，计算频率F2和步骤四中所述频率F1的差值ΔF′，频率F2和频率F3的差值ΔF″，当ΔF″/ΔF′≥30%时判定检测物中含有可卡因；所述缓冲液为0.1M pH值为7.0的PBS缓冲液。