[发明专利]一种基因抑制细胞K562-siWnt5a及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种转基因细胞的构建，尤其涉及一种基因抑制细胞K562-siWnt5a及其制备方法。 

背景技术

Wnt5a 蛋白是一种分泌型的糖蛋白，属于Wnt家族，在不同肿瘤中，Wnt5a发挥着不同的作用，如在它能促使乳腺癌、黑色素瘤、胰腺癌等肿瘤生长甚至可促使肿瘤的侵袭，而在甲状腺肿瘤、结肠直肠癌等肿瘤中Wnt5a可能发挥着抑制肿瘤的作用。Wnt5a在肿瘤发生中的作用和机理仍不清楚。 

在前期的研究中，我们使白血病细胞K562细胞过表达Wnt5a基因，并研究过表达Wnt5a对K562细胞的生物学形状的影响（牛长春，司维柯，李军等。稳定过表达Wnt5a对K562细胞生物学性状的影响.第三军医大学学报. 2009;31(22):2199-2201.）。为了更全面的研究Wnt5a对K562的影响，在本发明中我们使用逆转录病毒的方法，用siRNA干扰K562细胞中Wnt5a基因的表达，使之处于稳定低表达水平。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种基因抑制细胞K562-siWnt5a，所述基因抑制细胞K562-siWnt5a有利于进一步的研究Wnt5a表达降低对白血病细胞的影响及机制。 

本发明的技术方案是： 

一种基因抑制细胞K562-siWnt5a细胞，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址是中国湖北武汉武汉大学，保藏日期是2012年7月12日，保藏编号为CCTCC NO:C201291，分类命名是K562-siWnt5a细胞。

所述基因抑制细胞包含SEQ ID NO:1所示的基因片段Wnt5a。 

所述基因抑制细胞进一步包含siRNA启动子，所述siRNA启动子可以来自以pSEB-HUS为载体的逆转录病毒。 

所述基因抑制细胞进一步包含siRNA启动子为H1、U6双启动子。 

制备基因抑制细胞K562-siWnt5a细胞的方法，包含下列步骤： 

1）质粒pSEB-HUS-Wnt5a的构建；

2）质粒pSEB-HUS-Wnt5a和pCL-Ampho去内毒素大量提取；

3）pSEB-HUS-Wnt5a和pCL-Ampho与脂质体2000共转染HEK293细胞；

4）感染K562细胞并筛选阳性细胞克隆；

5）鉴定阳性细胞克隆，获得所述基因抑制细胞K562-siWnt5a。

所述步骤1）可包含将基因片段Wint5a酶切后与pSEB-HUS载体连接。 

所述步骤5）鉴定阳性克隆的方法为Real-time PCR检测K562 mRNA表达水平及Western Blotting检测Wnt5a蛋白表达水平。 

本发明使用逆转录病毒作为载体，可以把外源性的siRNA启动子(H1,U6双启动子)和Wnt5a基因目标序列片段（ SEQ ID NO:1 :5-GTGGATAACACCTCTGTTT-3）整合到细胞的基因组中，从而能够稳定内源性表达Wnt5a而不丢失，便于对Wnt5a的研究。其不同于使用转染的方法把siRNA瞬间转入细胞。基因抑制细胞K562-siWnt5a细胞的构建，对于进一步研发白血病诊断和预后判断指标和Wnt5a作为基因治疗靶点的研究具有重要意义，有利于进一步的研究表达过表达Wnt5a对于白血病的作用以及机制。 

为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。 

附图说明

图1为Real-time PCR鉴定K562 mRNA表达水平结果； 

图2为Western Blotting 检测Wnt5a表达水平及JNK活性的变化；

图3 为pSEB-HUS质粒图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，应理解的是，这些实施例仅用于说明本发明而不是对本发明的限制，在本发明的构思前提下对本发明基因抑制细胞K562-siWnt5a及制备方法的简单改进，都属于本发明要求保护的范围。 

本发明以质粒pSEB-HUS-Wnt5a为载体包装逆转录病毒，构建基因抑制细胞K562-siWnt5a细胞，达到了使K562细胞中Wnt5a表达水平下降的效果，并且表明Wnt5a表达水平的下降可以导致JNK活性的降低。