[发明专利]一种用于定量检测FMDV有效抗原的反向液相阻断ELISA方法

权利要求书

1.一种用于定量检测FMDV有效抗原的反向液相阻断ELISA方法，其特征在于通过将标准阳性血清的稀释方法固定以达到固定血清的量的目的，并将待检抗原作系列稀释与之作用，同时设置已知有效抗原含量的标准对照抗原，参考阳性标准血清在某一抗体效价下阻断50%标准对照抗原的有效抗原量的测定结果，基于标准阳性血清在某一恒定的抗体效价下其50%阻断有效抗原量是一定的这一抗原抗体反应原理，通过以下公式计算得到：

其中，血清的具体抗体滴度按以下公式计算得到：

血清抗体滴度D=1/2^n+s

其中，n为略低于临界值的稀释滴度的连续稀释倍数的指数；

临界值（OD_50%）:即标准对照抗原平均OD_492nm值的50%。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的标准对照抗原为已知有效抗原含量的抗原，包括纯化的146S抗原，经146S标定过的已知有效抗原含量的普通抗原。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述的标准对照抗原为经蔗糖密度梯度离心纯化得到的146S抗原。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，具体的包括以下步骤：

（1）标准阳性血清抗体滴度测定；

（2）FMDV 146S抗原的纯化及含量测定；

（3）标准阳性血清在其抗体滴度下阻断50%时146S有效抗原量的测定；

（4）待检FMDV样品有效抗原量的标定

a、包被ELISA板

用pH值9.60.05M碳酸盐缓冲液将兔抗FMDV血清稀释并包被ELISA板，室温过夜，PBST洗板5次；

b、按每孔50μl量在抗原抗体反应板上用pH值7.4的PBST将阳性标准血清按比例作2倍连续稀释，按每孔50μl量在血清稀释孔内加入按不同比例稀释的FMDV抗原以及作为标准对照抗原的146S抗原，不同浓度稀释的待检FMDV抗原和作为标准对照抗原的146S抗原均设4孔不加血清稀释液的抗原作为对照，100μl/孔，其中146S抗原量为阳性标准血清在其抗体滴度下50%阻断时146S抗原含量；

c、洗板和转移

将载体板上的抗原抗体混合物按次序平移至ELISA板上，50μl/孔，封板，37℃孵育1小时；洗板，将与兔抗血清同源的FMDV豚鼠抗血清用含10%正常牛血清和5%健康兔血清的PBST稀释至工作浓度，50μl/孔，封板，37℃孵育1小时；

d、酶促反应

洗板5次，加入用PBST稀释的兔抗豚鼠IgG辣根过氧化物酶结合物，50μl/孔，封板，37℃孵育1小时；洗板5次，加入底物溶液，50μl/孔，37℃孵育15分钟，再每孔加入50μl量的1.25%H₂SO₄终止反应，酶标仪492nm波长下读取吸光值；

（5）被检FMDV抗原有效抗原量计算：

其中，血清的具体抗体滴度按以下公式计算得到：

血清抗体滴度D=1/2^n+s

n为略低于临界值的稀释滴度的连续稀释倍数的指数；

临界值（OD_50%）:即标准对照抗原平均OD_492nm值的50%。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于将所述的标准对照抗原替换为经146S标定过的已知有效抗原含量的普通抗原，所述的普通抗原按照权利要求4中步骤（3）的方法标定。