[发明专利]一种用于定量检测FMDV有效抗原的反向液相阻断ELISA方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于检测FMDV有效抗原的新方法，特别涉及一种可用于分型、测定血清FMD抗体的液相阻断ELISA检测方法、一种可定量FMDV中146S抗原含量的蔗糖梯度离心方法以及标定血清抗体某一抗体效价下50%阻断有效抗原量的方法。本发明属于生物技术领域。

背景技术

口蹄疫（Foot and Mouth Disease,FMD）是猪、牛、羊等主要家畜和其它家养、野生偶蹄动物共患的一种急性、热性、高度接触性传染病，易感动物达70多种。临床特征是在口腔黏膜、蹄部和乳房皮肤发生水泡性疹。该病传播途径多、速度快，曾多次在世界范围内暴发流行，造成巨大政治、经济损失。世界动物卫生组织（OIE）将其列为必须申报的传染病，我国也将其列在一类动物传染病的首位。口蹄疫病毒(Foot and Mouth Disease Virus,FMDV)属于微核糖核酸病毒科口蹄疫病毒属。目前已知口蹄疫病毒在全世界主要有七个血清型:O、A、亚洲1、C型及南非1、2、3型，疫苗免疫不能使各型之间交叉保护。现阶段我国主要针对O、A和亚洲1型进行疫苗免疫。

疫苗接种与扑杀相结合是发展中国家预防、控制乃至逐步消灭口蹄疫最为常用的手段。随着新技术的发展，出现了以表位疫苗、类病毒样颗粒、合成肽为代表的新型疫苗，但是传统的口蹄疫灭活疫苗仍然在我国口蹄疫控制中发挥着主要作用。现阶段疫苗生产中口蹄疫病毒的繁殖已经开始由传统的转瓶BHK21细胞单层培养法向BHK21细胞悬浮培养方法过渡，BHK21细胞悬浮培养方法由于其在病毒培养中的巨大优势引起了疫苗生产厂家的重视。口蹄疫病毒主要采用二乙烯亚胺（BEI）灭活，病毒灭活彻底，并且灭活前后抗原含量变化小，免疫佐剂以油佐剂为主。

FMD疫苗的效力试验主要采用本动物进行免疫攻毒试验，即PD50测定法:用疫苗50%动物保护剂量(PD50)来评价疫苗免疫效果，常规疫苗需至少达到3PD50，紧急接种疫苗需至少达到6PD50。目前，发达国家已经采用本动物替代方法检测FMD疫苗的效力，该检测方法也是我国FMD疫苗生产急需解决的关键技术之一。FMD疫苗效力检验替代方法主要有疫苗抗原定量方法和血清学测定口蹄疫抗体替代法。

FMD疫苗抗原定量主要有免疫扩散法、间接夹心ELISA146S抗原定量法、蔗糖密度梯度离心法。口蹄疫病毒抗原定量的方法目前常用的是蔗糖密度梯心纯化146S方法和间接夹心ELIA方法测定146S含量方法。蔗糖密度梯度离心纯化测定完整病毒粒子（146S）含量是最常用的的方法。根据沉降系数不同，可以分为完整病毒粒子（146S）、空衣壳(76S)、病毒感染相关肽(45S)、小分子蛋白（12S）。146S抗原是口蹄疫疫苗中使动物肌体产生保护性抗体的主要免疫成分，因此146S抗原颗粒也被认为与口蹄疫疫苗的效力具有平行关系。1971年，Fayet等首次建立了用紫外光定量蔗糖梯度中口蹄疫病毒粒子146S抗原颗粒的方法；1974年，Barreling等在此基础上做了改进，使此方法更加精确敏感。Doel等进一步发展和标准化了这个方法，并于1982年向OIE正式推荐了这个方法。1990年，Junsuke等用蔗糖密度梯度离心法对口蹄疫灭活疫苗中的146S抗原颗粒纯化后，用软件CDS系统对146S抗原颗粒实现了电脑自动化定量。有研究者还开展了146S抗原颗粒含量与疫苗的本动物效力(PD50)相关性的研究。试验证明，在一定的范围内，146S抗原颗粒的含量与疫苗效力有相关性。

由于蔗糖密度梯度离心测定146S抗原不能区分血清型，而ELISA方法在技术操作要求、FMDV定型、批量检测等方面具有优势，研究者一直探索用ELISA方法解决抗原定量问题。Van Maanen等1990年用针对VP1的单克隆抗体双抗夹心ELISA法定量FMD疫苗的146S含量；Crowther等1995年利用诊断VP1的单克隆抗体建立能区分146S和12S的双抗夹心法。单克隆抗体作为捕获抗体不能完全辨别抗原的所有功能区域，不能完全反映抗原的免疫原性和本动物接种疫苗后一系列复杂的免疫反应；基于多克隆抗体建立的双抗夹心ELISA，由于同型FMD毒株间存在许多亚型，要想定量准确，必须使捕获抗体和检测抗体与要检测的抗原以及标准对照抗原同源，在未知被检测的毒株来源的情况下，该方法也很不理想。