[发明专利]pUC19-TVG质粒的构建及使用方法

权利要求书

1.一种能够有效解决基于酶切位点基因融合问题的新载体pUC19-TVG，其特征在于多克隆位点处序列为(SEQ ID NO：1)，其结构如图1所示。

2.一种构建载体pUC19-TVG的方法，其特征在于具体构建步骤包括：

1)引物设计及基因扩增

a.根据pUC19中多克隆位点区域序列设计反向引物TvectorG，

TvectorG：5′-AAGCTTGCGGCCGCACGCGTTATTCGCAGCATCCTCCG-3′(SEQ ID NO：2)；

其中TvectorG的5′端包含酶切位点HindIII、Not I、Mlu I(下划线所示)，为构建质粒及基因拼接提供连接端；

b.在TvectorG和pPICZα通用引物5′AOX(5′-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3′)的作用下，以pPICZα质粒为模板扩增出TVG片段并连至pUCm-T载体上，新载体命名为pUCm-T-TVG；

2)pUC19-TVG质粒的构建

a.对pUC19及pUCm-T-TVG载体使用Hind III和EcoR I进行双酶切，并回收pUC19大片段及基因TVG；

b.使用T4DNA连接酶对以上两步获得的片段进行连接，得到新载体pUC19-TVG。

3.一种基于pUC19-TVG质粒的基因融合方法，其特征在于具体构建步骤包括：

1)目的基因含酶切位点的引物设计

为实现目的基因A和B的融合，首先根据两基因的末端序列设计含有包括酶切位点EcoRI、Mlu I、Not I、Xho I、Hind III在内的两对引物，限制性酶切位点可根据后续步骤所连载体进行选择其中每个基因所使用的酶切位点前后不同、两基因所使用的酶切位点前后对应；使用该引物分别以目的基因A和B为模板进行PCR；PCR产物回收后连接至pUCm-T载体上并获得质粒pUCm-T-A和pUCm-T-B；

2)目的基因A与pUC19-TVG载体的连接

使用所选择的两种限制性内切酶对质粒pUC19-TVG和pUCm-T-A进行双酶切，酶切回收pUC19-TVG大片段及A基因并使用DNA连接酶进行连接，获得质粒pUC19-TVG-A；

3)目的基因A与B的融合

使用所选择的两种限制性内切酶中的任意一种和两目的基因中均含有的单酶切位点对质粒pUC19-TVG-A和pUCm-T-B进行双酶切，回收pUC19-TVG-A质粒大片段和B基因片段并使用DNA连接酶进行连接，获得包含融合基因的质粒pUC19-TVG-AB。