[发明专利]构建特异性启动子的方法

权利要求书

1.用于选择启动子元件的方法，其包括：

(a)提供多个转录因子调控元件(TFRE)，其中所述多个TFRE中的每一个与多个基因中的一个或更多个相关联，所述多个基因中的每一个在特定细胞类型或组织类型中或者在特定条件下差异表达；和

(b)从步骤(a)中提供的所述多个TFRE中选择TFRE，其中每一个所选TFRE(1)在超过50％的步骤(a)中定义的所述多个基因的20千碱基以内，和(2)SYN值大于0.3，其中TFRE的SYN值定义为频率^(1/长度)，其中频率是其在所述多个基因中任一个的20千碱基以内的频率，长度是所述TFRE的核苷酸长度。

2.用于制备转录增强的组合启动子盒的方法，所述方法包括：

(a)鉴定多个转录因子调控元件(TFRE)，其中所述多个TFRE中的每一个与多个基因中的一个或更多个相关联，所述多个基因中的每一个在特定细胞类型或组织类型中或者在特定条件下差异表达；

(b)从步骤(a)中提供的所述多个TFRE中选择TFRE，其中每一个所选TFRE(1)在超过50％的步骤(a)中定义的所述多个基因的20千碱基以内，和(2)SYN值大于0.3，其中TFRE的SYN值定义为频率^(1/长度)，其中频率是其在所述多个基因中任一个的20千碱基以内的频率，长度是所述TFRE的核苷酸长度；

(c)通过随机组合步骤(b)中所选择的TFRE来构建随机组合元件的文库；以及

(d)将所述文库中的组合元件插入到具有最小启动子和报告基因的载体中，从而产生组合启动子盒。

3.根据权利要求2所述的方法，其还包括步骤(e)：将所述载体插入到宿主细胞中。

4.根据权利要求3所述的方法，其中步骤(e)产生多个宿主细胞，所述方法还包括(f)：从步骤(e)中产生的宿主细胞中筛选报告基因的表达增强的那些。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其还包括鉴定步骤(e)中所产生的宿主细胞或步骤(f)中所选择的宿主细胞中的所述组合启动子盒。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中步骤(b)中选择的每一个TFRE的SYN值大于0.5。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中步骤(b)中选择的每一个TFRE具有在步骤(a)中提供的所述多个TFRE中第一至第十大的SYN值。

8.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中步骤(b)中选择的每一个TFRE在超过50％的步骤(a)中所述多个基因的10千碱基或5千碱基内，优选在上游区域内，频率为在超过50％的所述多个基因的10千碱基或5千碱基内的频率，优选在上游区域内的频率。

9.根据权利要求2至8中任一项所述的方法，其中通过在连接反应条件下将至少编码所选TFRE的各个双链DNA序列元件混合在一起来制备步骤(c)中的随机组合的所选TFRE的文库。

10.根据权利要求2至9中任一项所述的方法，其中步骤(d)中的所述报告基因是LacZ或GFP。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述多个基因中的每一个在特定条件下差异表达，所述特定条件是疾病条件。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述疾病条件是癌症。

13.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述多个基因中的每一个在特定条件下差异表达，所述特定条件是暴露于特定生物物质、化学物或微生物病原。

14.一种载体，其包含组合启动子盒，所述组合启动子盒包含随机组合元件、最小启动子和报告基因，

其中每一所述元件与超过50％的多个基因20千碱基以内的并且SYN值大于0.3的TFRE具有大于80％的序列同一性，所述多个基因被鉴定为在特定细胞类型或组织类型中或者在特定条件下差异表达，其中所述SYN值定义为频率^(1/长度)，其中频率是所述TFRE在所述多个基因中任一个的20千碱基以内的出现频率，长度是所述TFRE的核苷酸长度，并且

其中所述载体是质粒、病毒，其瞬时表达或整合在宿主细胞的基因组中。