[发明专利]用于亲和层析的洗涤溶液和方法

说明书

本发明提供用于亲和层析的洗涤方法，其中包含精氨酸或精氨酸衍生物、pH大于8.0的洗涤溶液在没有非缓冲盐的情况下有效移除杂质，而同时增加洗脱物中的产物浓度并维持高百分比产量的回收产物。

发明背景

在亲和层析期间有效移除杂质是蛋白下游加工中的关键因素，所述杂质包括宿主细胞蛋白(HCP)和产物相关杂质，如高分子量(HMW)和低分子量(LMW)物质。第一纯化步骤(“捕获步骤”)后的蛋白纯度显著影响生成纯化产物所需的后续步骤的类型和数目。所述捕获步骤同样关键，因为其浓缩产物，其使得在后续纯化步骤中可以应用按比例而言更小、费用更低的柱。因此，在第一层析步骤中优化杂质移除是重要的。在抗体纯化的情况中，该第一步骤通常基于对蛋白A或衍生物的亲和性。

需要低pH条件(如pH3–4)以从亲和柱中洗脱结合的目标蛋白，但低pH条件存在可能引起聚集的弊端。历史上，使用不太严格的条件如pH5–5.5以从柱中洗涤非特异性结合的杂质，而同时保留目标蛋白-蛋白A相互作用。然而，由于这些条件下(特别是在高加样密度下运作时)的目标蛋白部分洗脱，回收通常减少。

已显示氨基酸精氨酸使某些沉淀蛋白溶解(M,Tsumoto K,Nitta S,Adschiri T,Ejima D,Arakawa T和Kumagai I.Biochem.Biophys.Res.Commun.328,189-197(2005);Umetsu M,Tsumoto K,Hara M,Ashish K,Goda S,Adschiri T,Kumagai I.J BiolChem.2003年3月14日;278(11):8979-87)，减少聚集物形成(Arakawa T,TsumotoK.Biochem Biophys Res Commun.2003年4月25日;304(1):148-52)和Arakawa T,Biophys.Chem.127(2007),第1–8页(综述))并降低蛋白与表面的非特异性吸附(Ejima D,JChromato A,05和Schneider CP,J.Phys.Chem.B113(2009),第2050–2058页)。此外，与盐酸胍相反，未显示精氨酸使蛋白去折叠(Arakawa T,Biochem.Biophys.Res.Commun.304(2003),第148–152页和Nakakido M,Biophys.Chem.137(2008),第105–109页)。

如此，已使用精氨酸从亲和层析柱和其他类型纯化柱中洗脱蛋白。例如，Arakawa等描述使用包含0.5-2.0M精氨酸、pH4.1-5.0的洗脱缓冲液从蛋白A柱洗脱抗体的方法(Arakawa等.(2004)Protein Expression and Purification36:244-248;Tsumoto,K.等.(2004)Biotechnol.Prog.20:1301-1308;美国专利公开号20050176109)。另外，Ejima等的美国专利号7,501,495描述通过包含盐酸精氨酸的流动相溶液(developing solution)从凝胶过滤柱中洗脱蛋白的方法。Ghose等描述使用精氨酸梯度作为洗脱剂从未衍生化硅石中洗脱感兴趣的蛋白的方法(Ghose,S.等.(2004)Biotech.Bioeng.87:413-423)。Coffman等的美国专利公开号20030050450描述从包含Fc的分子与蛋白A的复合体中分离包含Fc的分子的方法，其中Fc/蛋白A复合体被加至疏水性相互作用柱(HIC)且所述柱用包含精氨酸的缓冲液洗涤。