[发明专利]一种检测甘蔗黄锈病菌的实时荧光定量PCR方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种甘蔗病原菌的检测方法，具体涉及一种检测甘蔗黄锈病菌的实时荧光定量PCR方法，属于生物技术领域。

背景技术

甘蔗黄锈病（Sugarcane orange rust disease）是由属于屈恩柄锈菌的甘蔗黄锈病菌（Puccinia kuehnii）引起的一种真菌性病害。病原菌可经由风快速传播，然后通过气孔侵入，造成感病品种蔗茎产量损失和蔗糖分的降低。初次侵染源主要来自甘蔗本身或其他中间寄主。控制甘蔗黄锈病发生的首要措施为培育和栽种抗黄锈病甘蔗品种。

甘蔗黄锈病菌的检测及其效率和准确性直接影响甘蔗抗黄锈病育种的进程和效果。迄今，已经有三种方法被证明可用于检测待检测甘蔗品种中是否含有黄锈病菌：第一种是分离培养技术，在建立纯培养物的基础上，根据培养物所产生孢子的形态特征进行鉴定；第二种是根据田间种植后病害表型症状鉴定；第三种是常规PCR检测技术。以上三种方法中，分离培养技术中分离培养以及最终建立纯培养物需要时间长，加上分离过程杂菌污染等，都会影响分离效果，检出效率不高；田间基于诱发的抗病性鉴定方法，鉴定结果不够稳定，而且还存在不同地点、不同年份间的鉴定结果有较大的差异以及耗时长达几个月等逆势；常规PCR检测技术灵敏度不够高，且无法实时监测PCR过程。实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过样品到达域值水平所经历的循环数（Ct值）对未知模板进行定量分析的方法。与常规PCR检测技术相比，实时荧光定量PCR检测技术，灵敏度高，特异性好，样品消耗少，仅需1-10 ng的总RNA或基因组DNA，还能实时直观地监测P CR扩增过程。综上，目前已有的三种甘蔗黄锈病菌检测技术，均有待进一步改进和完善，急需建立一种简便、快速、准确和灵敏度高的检测甘蔗黄锈病菌的实时荧光定量PCR方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测甘蔗黄锈病菌的实时荧光定量PCR方法，可用于田间甘蔗黄锈病菌的早期诊断及检测。

    本发明的一种检测甘蔗黄锈病菌的实时荧光定量PCR方法，包括基因组DNA提取、实时荧光定量PCR检测体系建立、实验有效性判定以及实时荧光定量PCR检测，其特征在于： 

1、实时荧光定量PCR检测体系的建立：实时荧光定量PCR扩增体系总体积为25 μl，内含12.5 μL 2×TaqMan Universal Master Mix，10 μmol/L的检测引物qPCR-F和qPCR-R各0.75 μL，0.4 μL 10 μmol/L探针，5-10 ng基因组DNA，ddH₂O补足到25 μl； PCR扩增程序如下：50 ℃ 2 min，94 ℃ 10 min；90 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40个循环，在60 ℃进行单点荧光检测；所述检测引物和探针如下：      

qPCR-F：5'- TAACAATGGATCTCTAGGC -3'，

qPCR-R：5'- GTTAATAATGAGGTTTCCC -3′,

探针：5'- FAM-TATAACATTATCCCC-TAMRA-3′。

2、实验有效性判定

同时具备a、b、c三个条件的实验为有效实验，否则为无效实验；所述a、b、c三个条件如下：a、空白对照，无Ct值且无典型的扩增曲线；b、阴性对照，无Ct值且无典型的扩增曲线；c、阳性对照的Ct值≤30.0，并出现典型的扩增曲线；所述典型的扩增曲线如图1所示，为S型动力学曲线；阈值线为以阴性对照样品扩增曲线的最高点为基准，与横坐标平行的一条直线；阈值线和典型的扩增曲线的交点所对应的定量PCR扩增循环数为Ct值；阳性对照为已知含甘蔗黄锈病菌的样品；阴性对照为已知不含甘蔗黄锈病菌的样品；空白对照指用等体积的无菌ddH₂O代替模板DNA；

3、实时荧光定量PCR检测

实时荧光定量PCR检测中，样品检测结果如下：

A、无Ct值且无典型的扩增曲线，表示样品中不含甘蔗黄锈病菌；

B、Ct值≤35.0，且出现典型的扩增曲线，表示样品中含甘蔗黄锈病菌；

C、当Ct值＞35.0，则该样品做重复实验；重复实验结果无Ct值，则该样品中不含甘蔗黄锈病菌；若重复实验结果有Ct值且有典型的扩增曲线，则该样品中含甘蔗黄锈病菌。

本发明的应用效果：