[发明专利]制备二肽基肽酶IV抑制剂的方法及用于该制备方法的中间体

权利要求书

1.一种制备式2结构的胺的方法，

式2

其包括

a.使用甲酸铵、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、二硫苏糖醇及部分纯化的苯丙氨酸脱氢酶/甲酸脱氢酶(PDH/FDH)处理式1结构的酮酸的水溶液；及

式1

b.使用氢氧化钠调节反应混合物的pH以形成基本上不含有不希望的过量铵离子的所需的胺。

2.权利要求1的方法，其中进行调节反应混合物的pH的步骤以将反应混合物的pH维持在约7.0至约8.6。

3.权利要求1的方法，其中进行调节反应混合物的pH的步骤以将反应混合物的pH维持在8.0±0.2。

4.权利要求1-3中任一项的方法，其中以这样的量添加甲酸铵，以提供约1.9:1至约2.5:1的范围内的甲酸铵:式1酸的摩尔比例。

5.权利要求1-4中任一项的方法，其中以这样的量添加烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，以提供约500:1至约1500:1的范围内的NAD:式1酸的摩尔比例。

6.权利要求1-5中任一项的方法，其中步骤c的反应混合物维持在约25℃至45℃的范围内的温度。

7.权利要求1的方法，其中将该3-羟基-α-酮基三环[3.3.1.1^3,7]癸烷-1-乙酸、甲酸铵、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、二硫苏糖醇及部分纯化的苯丙氨酸脱氢酶/甲酸脱氢酶的水溶液加热到约35至约40℃的温度且将其pH维持在约7.8至约8.2的范围内达约24至约48小时，以制备该胺。

8.一种制备式3结构的经BOC-保护的胺的方法

式3

其包括

a.提供下述结构的氨基酸(αS)-α-氨基-3-羟基三环[3.3.1.1^3,7]癸烷-1-乙酸的水溶液

其是根据权利要求1-7中任一项的方法而制备的，及

b.使用二碳酸二叔丁酯处理上述水溶液以形成该经BOC-保护的胺。

9.权利要求8的方法，其中该(αS)-α-氨基-3-羟基-三环[3.3.1.1^3,7]癸烷-1-乙酸的水溶液和二碳酸二叔丁酯的混合物的pH维持在约8.5至约12.5的范围内。

10.权利要求8的方法，其进一步包括从该反应混合物中离析该经BOC-保护的胺且对该经BOC-保护的胺进行结晶的步骤。

11.权利要求1-10中任一项的方法，其中部分纯化的苯丙氨酸脱氢酶/甲酸脱氢酶(PDH/FDH)是通过包括下述的方法制备的：

a.制备能够产生苯丙氨酸脱氢酶和/或甲酸脱氢酶的微生物的发酵培养液；

b.对该培养液进行微流体化以从所得的细胞中释放出活性且形成含有PDH及/或FDH酶的微流体化的培养液；

c.经由使用絮凝剂处理该培养液以凝结细胞碎屑而澄清该培养液，并除去DNA和不需要的蛋白质；

d.过滤该澄清的培养液；及

e.浓缩该培养液以得到具有对于PDH为至少约400IU/毫升和对于FDH为至少约20IU/毫升的PDH/FDH活性的经纯化的酶浓缩物。

12.权利要求11的方法，其中在保持该培养液的温度低于约40℃的同时对该培养液进行微流体化。

13.权利要求12的方法，其中保持该培养液的温度在约4℃至约30℃的范围内。