[发明专利]一种改造已知载体多克隆位点的方法

说明书

技术领域

本发明属于克隆技术领域，具体涉及一种改造已知载体多克隆位点的方法。

背景技术

应用双酶切对目标序列进行定向克隆是载体构建过程中最常用的方法。这一方法能极大地减少重组过程中的载体本身自连现象，提高构建效率。然而，在很多情况下，尤其是待克隆的目标DNA片段较长时，很难在已知载体的多克隆位点multiple cloning sites（简称MCS）中找到2个合适的限制性内切酶酶切位点。另外，在双酶切过程中，有些限制性内切酶之间的组合会严重降低彼此或其中之一的酶切效率，最终影响构建效率。因此，对载体的多克隆位点进行改造是分子生物学实验中的常见情况，而这时便需要一种简便、高效的多克隆位点改造方法。

目前，对载体的多克隆位点进行改造的方法主要有3种：1）直接合成一段双链DNA片段，双酶切消化、回收后连接至原载体。由于合成的片段较短，该方法在胶回收过程中的得率通常较低。2）基于连接子linker技术的方法，合成两个含所需酶切位点的互补的寡核苷酸序列，常规引物5’末端为羟基，用于连接子的引物5’末端需磷酸化，在PCR反应中通过退火获得具有粘性末端的双链的DNA片段，尔后不经过胶回收，直接与待改造的载体进行常规的酶切连接反应，完成原载体多克隆位点的改造。然而，由于不经过胶回收，导致原退火反应中的缓冲液残留会影响下一步连接酶的连接效率。3）以另一载体的多克隆位点为来源，通过酶切、回收、再连接至待改造载体的多克隆位点中。然而，由于载体中的多克隆位点序列通常较短，为100bp左右，使得酶切后的片段在胶回收中的得率通常不高，导致构建效率低。牛麟等提出在载体的MCS中插入一段238bp的辅助片段，尔后再用此MCS取代待被改造载体的MCS，最后再切除插入的辅助片段，完成载体的改造，但是该方法需要有原始的MCS模板序列，导致操作灵活性较低。

发明内容

本发明的目的在于提供一种改造已知载体多克隆位点的方法，以实现简便快捷、可操作性强、效率高地改造已知载体多克隆位点。

为了解决以上技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种改造已知载体多克隆位点的方法，即衔接子引物-PCR法，其特征在于包括以下步骤：步骤一，设计衔接子引物，用衔接子引物对目标片段进行扩增；步骤二，利用原载体已知酶切位点分别对扩增片段与原载体进行双酶切，酶切后进行凝胶电泳，切胶后采用凝胶回收试剂盒回收目标片段，片段回收后通过T4 DNA连接酶进行连接反应；步骤三，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，挑取阳性克隆，提取质粒，验证新引入的酶切位点的正确性。

所述步骤一中设计衔接子引物的方法为：以实验中现有的在动植物或昆虫等物种基因组中扩增效率较好的引物对为基础引物，避免基础引物及其扩增序列中包含所要添加的酶切位点，扩增序列长度在1Kb以内；在基础引物对的前引物5’端依次添加酶切保护碱基、待改造载体多克隆位点中的某一酶切位点序列以及需添加的酶切位点序列，获得衔接子前引物序列；在基础引物对的后引物5’端依次添加保护碱基、待改造载体多克隆位点中另一酶切位点序列以及需添加的酶切位点序列，获得衔接子后引物序列；以衔接子前后引物对，扩增原基础引物扩增的基因组DNA即模板DNA，获得目标片段。

所述衔接子引物-PCR法的反应体系为20μl，包含2μl即100ng模板DNA、2μl的10×聚合酶缓冲液、0.4μl的10mM dNTP；0.4μl 的10μM衔接子前后引物各，1μl的高保真聚合酶、13.8μl的超纯水；PCR方法的过程为：在94℃下预变性5 分种；在94℃下变性 30秒，在55℃下退火30 秒，在72℃延伸1 分种，循环35次；在72℃下延伸5 分钟； 12℃保温2小时；退火温度根据所设计引物的基础引物退火温度作相应调整。

所述步骤二中双酶切体系中各试剂及用量分别为：扩增片段酶切体系为60ul， 试剂包括20μl的衔接子引物扩增片段、6.0μl的10×内切酶缓冲液、1.0μl的内切酶I、1.0μl的内切酶II和32μl的超纯水；载体酶切体系为60ul，试剂包括15μl即600ng的载体、6.0μl的10×内切酶缓冲液、1.0μl的内切酶I、1.0μl的内切酶II和37μl的超纯水。