[发明专利]微生物聚集体定量显微成像测定及评价方法

权利要求书

1.微生物聚集体定量显微成像测定及评价方法，其特征是按如下步骤进行：

a、按如下步骤标定待测微生物聚集体样本的灰度值与比重值标准关系曲线：

a1、以1.0°Bx为糖度梯度，取糖度从5.0°Bx到21.0°Bx的蔗糖水溶液共17组，标记为蔗糖水溶液m，m=1，2，…，17；

a2、从待测微生物聚集体样本中取含有微生物聚集体的混合液，测试所述混合液的质量浓度值，记为p，以蒸馏水作为溶剂将所述混合液稀释到质量浓度值为p/100，获得待标定混合液样本；

a3、使用胶头吸管从待标定混合液样本中吸取一个微生物聚集体，将所述微生物聚集体无初速滴入蔗糖水溶液1中，静置30秒；若所述微生物聚集体在所述蔗糖水溶液1中悬浮，则将蔗糖水溶液1的糖度标记为所述微生物聚集体的比重值，否则，将其取出并无初速滴入蔗糖水溶液2中，静置30秒，若所述微生物聚集体在所述蔗糖水溶液2中悬浮，则将蔗糖水溶液2的糖度标记为所述微生物聚集体的比重值，否则，将其取出并无初速滴入蔗糖水溶液3中，静置30秒，……以此类推，直到所述微生物聚集体在蔗糖水溶液m中悬浮，将蔗糖水溶液n的糖度标记为所述微生物聚集体的比重值；

a4、将所述微生物聚集体取出，置于蒸馏水中清洗两次，得到洁净微生物聚集体；将所述洁净微生物聚集体置于10ml水中形成洁净微生物聚集体混合液；

a5、吸取洁净微生物聚集体混合液，制成玻片，利用数码显微镜获取玻片图像，记录所述玻片图像中微生物聚集体所在区域的R值、G值和B值，并由所述R值、G值和B值计算得到所述微生物聚集体的灰度值；

a6、重复a3-a5，直到获得30组微生物聚集体的比重值和灰度值；采用最小二乘法处理所述30组微生物聚集体的比重值和灰度值，获取待测微生物聚集体样本的灰度值与比重值标准关系曲线；

b、以面积和比重值作为两项评价指标，按如下步骤计算待测微生物聚集体样本的评价指标值x_ij；

其中i为评价指标类型，i=1，2；j为待测微生物聚集体编号，j=1，2，…，n；

当i=1时，x_1j为第j个待测微生物聚集体的面积；

当i=2时，x_2j为第j个待测微生物聚集体比重值；

b1、取含有待测微生物聚集体的混合液制成待测玻片，利用数码显微镜获取待测玻片图像；将所述待测玻片图像的羽化值固定为10，选取所述待测玻片图像中所有的待测微生物聚集体，并从1到n对所有待测微生物聚集体进行编号，n=1，2，3……；记录n个待测微生物聚集体的分辨率、R值、G值和B值；

b2、根据b1所得的分辨率、R值、G值和B值，逐一计算n个待测微生物聚集体的灰度值和面积x_1j；

b3、利用步骤a获得的灰度值与比重值标准关系曲线和步骤b2获得的灰度值，分别获取n个待测微生物聚集体的比重值x_2j；

c、采用模糊模式识别方法，对所述待测微生物聚集体的面积x_1j和比重值x_2j进行综合评价，获得级别特征值向量H（j），以所述级别特征值向量H（j）作为待测微生物聚集体的评价结果，具体步骤如下：

c1、将所述待测微生物聚集体的评价指标值x_ij写入实测值矩阵X：

X=x11x12...x1nx21x22...x2n=(xij)]]>

c2、将x_ij的最大值记为y_il，将x_ij的最小值记为y_ic；

c3、将x_ij按评价指标类型分别进行级别分类，每个级别的标准值设为y_ih，其中y_1h表示第h个级别面积的标准值，y_2h表示第h个级别比重值的标准值，设h为1，2，…，5，将y_ih写入评价指标矩阵Y：

Y=y11y12...y15y21y22...y25=(yih)]]>

c4、根据模糊数学相对隶属度的概念，将实测值矩阵X转化为对应的相对隶属度矩阵R，将评价指标矩阵Y转化为对应的相对隶属度矩阵S：

R=r11r12...r1nr21r22...r2n=(rij)]]>

S=s11s12...s15s21s22...s25=(sih)]]>

其中：

rij=0,xij≤yicxij-yicyil-yic,yic<xij<yil1,yil≤xij]]>

sih=0,yih=yicyih-yicyil-yic,yic<yih<yil1,yil=yih]]>

c5、判断第j个待测微生物聚集体的面积相对隶属度r_1j在矩阵S的第1行向量（s₁₁，s₁₂，...，s₁₅）所处的级别上限值b_1j和级别下限值a_1j，判断第j个待测微生物聚集体的比重值相对隶属度r_2j在矩阵S的第2行向量（s₂₁，s₂₂，...，s₂₅）所处的级别上限值b_2j和级别下限值a_2j，取a_1j、a_2j中最小的值作为第j个待测微生物聚集体的级别下限值a_j，取b_1j、b_2j中最大的值作为第j个待测微生物聚集体的级别上限值b_j；

c6、建立实测值矩阵X的权重矩阵，将所述权重矩阵归一化得综合权重矩阵W：

W=w11w12...w1nw21w22...w2n=(wij)]]>

式中w_ij表示样本j的评价指标i的权重，且

c7、按式（1）计算级别特征值向量H（j）：

H(j)=Σh=15μhjh---(1)]]>

式（1）中：

dhj={Σi=12[wij(rij-sih)]2}12]]>

uhj=0,h<ajor,h>bj1Σk=ajbj{Σi=12[wij(rij-sih)]2Σi=12[wij(rij-sik)]2},aj≤h≤bj,dhj≠01,dhj=0]]>

。