[发明专利]一种生产青蒿二烯的酵母菌及构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生产青蒿二烯的酵母菌及构建方法。

背景技术

青蒿素是一种有效的抗疟疾药物，传统的获得方法包括为对植物青蒿进行提取，但青蒿虽然广泛分布于世界各地，但其中青蒿素含量随产地不同有很大差异。除我国海南、福建、重庆、广西部分地区外，世界上大部分地区的青蒿中青蒿素的含量都很低（不足1%），不具备工业提取价值，且青蒿遗传性状不稳定，产量受气候影响很大，导致青蒿素产量很不稳定；植物原料的分离和提取工艺使用大量的工业酸和碱，并产生严重超标的废水。同时，不能被有效地二次利用的残渣易引起水体富营养化，且大量砍伐青蒿为环境不友好行为；植物细胞培养的方法虽然解决了大规模砍伐青蒿的问题，却因植物细胞生长周期较长，故获得青蒿素的效率也并不高；化学合成法不仅合成步骤复杂，有很多副产物，且成本昂贵。

人类健康、能源、环境等领域的重大需求也牵引着合成生物学的迅猛发展。将基因元件(启动子、转录调控区域、核糖体结合位点、开放阅读框、终止子等)依据工程化目标需要，有机重构和连接起来，便形成了功能基因模块。通过对已有生物网络加以利用，同时引入新的功能基因模块，表达出天然细胞不能合成或含量极低的产物。

美国加利福尼亚大学Keasling教授的实验室在青蒿素生物合成的研究中作了大量卓有成效的工作，经过十几年的努力，青蒿素的大部分生物合成途径已经明确。青蒿二烯作为青蒿素合成途径中的关键前体，其产量的提升对青蒿素的合成具有十分重大的意义。

2003年，加利福尼亚大学伯克利分校Keasling课题组的Vincent等在大肠杆菌中首次实现了青蒿二烯的生物合成，产量为112.2mg/L。2006年，该课题组又在酿酒酵母中实现了青蒿二烯及青蒿酸的合成，产量分别为153mg/L和115m g/L。同年，Lindahl等在酿酒酵母中使用两种表达载体实现了青蒿二烯的合成，产量分别为100μg/L和600μg/L。此后，通过一系列优化，Keasling课题组于2008年在大肠杆菌中将青蒿二烯的产量提高到27.4mg/L，于2012年在酿酒酵母中将青蒿二烯的产量提高到超过40g/L。国内的孔建强等人也通过改造酿酒酵母底盘细胞、对青蒿二烯合酶基因（ADS）进行突变等方法，获得了最高产量为123.2mg/L的酿酒酵母工程菌。虽然青蒿二烯的微生物异源合成已经达到较高水平，外源模块与底盘细胞适配性的提高可以为产量的进一步提高提供可能。因此，在酵母中进行青蒿二烯及后续前体的合成具有独到的优势和重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种青蒿二烯合酶基因。

本发明的第二个目的是提供一种青蒿二烯合酶基因编码的蛋白质。

本发明的第三个目的是提供一种生产青蒿二烯的酵母菌的构建方法。

本发明的第四个目的是提供一种生产青蒿二烯的酵母菌的构建方法构建的酵母菌。

本发明的技术方案概述如下：

一种青蒿二烯合酶基因，它是序列表SEQ ID NO:9所述的核苷酸序列。

一种青蒿二烯合酶基因编码的蛋白质，它是序列表SEQ ID NO:10所述的氨基酸序列。

一种生产青蒿二烯的酵母菌的构建方法，包括如下步骤：

（1）载体SyBE_001317的构建：

将酵母启动子、ERG20基因、酵母终止子应用酶切连接的方法依次连入整合型载体，得到载体SyBE_001317；

（2）载体SyBE_001318的构建：

将酵母启动子、tHMGR基因、酵母终止子应用酶切连接的方法依次连入整合型载体，得到载体SyBE_001318；

（3）载体SyBE_001338的构建：

将酵母启动子、ERG20基因、融合蛋白连接肽、青蒿二烯合酶基因、酵母终止子与附加型载体采用酵母体内组装的方法拼接起来，得到载体SyBE_001338；

所述ERG20基因是序列表SEQ ID NO:3所述的核苷酸序列；

所述tHMGR基因是序列表SEQ ID NO:7所述的核苷酸序列；

所述青蒿二烯合酶基因是序列表SEQ ID NO:9所述的核苷酸序列；