[发明专利]一种小麦基因组定点改造方法

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，涉及一种小麦基因组改造方法。

背景技术

小麦是世界上最重要且广泛种植的农作物之一，对小麦基因组的改造有利于小麦基因组的研究，对提高产量，增强其对病虫害的抗性和农业发展有重要意义。目前，小麦突变体的创制和染色体改造主要是通过EMS诱变，物理诱变和染色体工程来获得，但这些方法费时费力，盲目性较大。当前的植物基因组工程（Genome engineering）技术中，主要通过锌指核酸酶（ZFNs）和转录激活子样效应因子核酸酶（TALENs）来做基因改造，但是在小麦基因定点改造还没有报道，而且这些技术操作过程复杂，成本高，技术难度较大，因此，亟待开发更加高效、廉价并且简单的小麦基因改造新技术。

最近发现的原核生物的第二类适应性免疫系统CRISPR（成簇的规律间隔的短回文重复序列）提供了另一个基因组改造的方法。第二类CRISPR系统广泛存在于细菌中，它们利用一个核酸内切酶Cas9为它们自身提供了防御病毒和质粒入侵的手段。Cas9可以和一个人工合成的引导RNA（guide RNA，gRNA）组成复合体，引导RNA由crRNA（CIRSPR RNA）和tracr RNA（trans-activating crRNA）融合产生。由gRNA引导Cas9核酸内切酶识别并切断靶向DNA。Cas9有两个关键的结构域：HNH和RuvC，它们分别切开DNA双链中的一条单链。产生DNA双链断裂（DSB），细胞启动修复机制，通过非同源末端连接（NHEJ）这种不精确的修复方式可以产生基因定点突变，通过同源重组（HR）方式修复可以实现精确的基因定点插入或基因替换。Cas9已经在细菌、人类细胞、斑马鱼和小鼠中成功进行基因组工程研究。

发明内容

本发明的一个目的，是提供一种实现小麦目的基因中靶标片段上的随机插入和/或随机缺失的基因改造方法。

本发明的实现小麦目的基因中靶标片段上的随机插入和/或随机缺失的基因改造方法，是利用CRISPR/Cas系统在小麦中对目的基因进行改造，该系统包括向导RNA和Cas9核酸酶，所述方法包含以下步骤：使小麦组织中含有向导RNA和Cas9核酸酶，然后在向导RNA和Cas9核酸酶共同作用下，目的基因上的双链靶标片段被剪切，再通过小麦细胞的自身DNA修复功能，最终实现小麦目的基因中靶标片段上的随机插入和/或随机缺失；

所述靶标片段位于所述目的基因上；所述双链靶标片段中的一条链具有如下结构：5’-N_X-NGG-3’，N表示A、G、C和T中的任一种，14≤X≤30；

所述向导RNA依次由能够与所述靶标片段互补结合的RNA片段和骨架RNA片段连接而成；所述骨架RNA片段依次由tracrRNA、crRNA嵌合形成类似发夹结构的RNA,所述骨架RNA片段可与Cas9核酸酶结合。

所述5’-N_X-NGG-3’中，19≤X≤21，具体X为19或20。

所述向导RNA中能够与所述靶标片段互补结合的RNA片段为能与所述5’-N_X-NGG-3’中N_X片段互补结合的RNA片段。

所述向导RNA中骨架RNA片段是由SEQ ID No.3中第386-469位核苷酸所示DNA转录出来的RNA。

所述使小麦组织中含有向导RNA和Cas9核酸酶的方法为：向小麦组织中直接转入所述向导RNA和带有核定位信号肽的Cas9核酸酶。

所述使小麦组织中含有向导RNA和Cas9核酸酶的方法为：向小麦组织中导入含有所述向导RNA的表达盒的重组克隆载体和含有所述带有核定位信号肽的Cas9核酸酶的编码基因的重组表达载体，所述向导RNA的表达盒在小麦组织中表达出向导RNA，所述带有核定位信号肽的Cas9核酸酶的表编码基因在小麦组织中表达出带有核定位信号肽的Cas9核酸酶。

所述向导RNA的表达盒由U6启动子和所述向导RNA的编码基因组成；所述向导RNA的编码基因由所述能与所述靶标序列互补结合的RNA片段的编码基因和所述骨架RNA片段的编码基因组成。

所述U6启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.3中第1-363位核苷酸序列所示。

所述重组表达载体中的出发载体为任一能够在小麦中表达外源基因的表达载体。如在构建含有带有核定位信号肽的Cas9核酸酶的编码基因的重组表达载体时，可使用出发载体pJIT163。