[发明专利]一种重组人干扰素β-1b冻干制剂及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术制药领域，更具体的涉及一种稳定的重组人干扰素β-1b冻干制剂及其制备方法。

背景技术

干扰素（interferons，IFN）是一类具有抗病毒活性、抑制细胞增殖、抗肿瘤和免疫调节功能的细胞因子，根据与受体结合的原则不同被分为两个亚型，其中I型目前包括IFN-а、IFN-β、IFN-τ、IFN-ω，Ⅱ型干扰素只有IFN-γ一种，根据制备方法的不同分为天然干扰素和基因工程重组干扰素。

干扰素作用机制研究表明，它并非直接作为反式作用因子对其效应分子的基因进行调控，而是借助受体介导的信号转导系统，引发一系列特异的生化反应而调控效应分子。IFN通过诱生多种抗病毒蛋白，抑制病毒在细胞中的复制，以增强NK细胞活性及其免疫调节能力，有效遏制病毒侵袭和感染的发生，抑制肿瘤细胞生长，清除早期恶变细胞。

自干扰素被发现以来，人们对其临床应用给予极大的希望。早期干扰素是用病毒和诱生剂诱导人体细胞产生自然干扰素，近年来，随着基因工程技术的不断发展，大量高效价的重组干扰素基因工程产品越来越多。以1980年干扰素基因的首次克隆为转折点，干扰素生产进入了基因工程时代。利用DNA重组技术将特定类型的干扰素基因整合到特定的生物载体上，通过诱导表达，分离提取纯化等复杂步骤，可以得到特定的干扰素单体，通过制剂工艺得到不同剂型的制剂，其中部分已在临床上得到广泛的应用，且疗效显著。

IFN-β为分子量约为20kD的糖蛋白，由166个氨基酸组成的单链蛋白。据报道重组人β-干扰素在大肠杆菌和仓鼠细胞中都有表达。已知重组β-干扰素能够有效的延缓多发性硬化症状患者多发性硬化的发展，减轻病人痛苦，同时在免疫调节和抗肿瘤方面也有一定效果。目前可以从商业上获得的重组β-干扰素的商品名有：Betaseron，Avonex，Rebif。其中Betaseron—注射用重组人干扰素β-1b是第一个被批准用于多发性硬化疾病的治疗性生物药，主要通过抑制神经中枢系统的免疫反应治疗多发性硬化疾病。

大肠杆菌中表达的IFN-β，纯化后表达产物活性低且很不稳定。其原因可能与第17位的Cys可在分子间形成二硫键有关。1984年，Mark等报道可用任何氨基酸替代第17位的Cys，从而获得一系列IFN-β的同系物。1993年美国FDA批准上市的Betaseron(IFN-β-1b)即为此类。大肠杆菌表达的重组IFN-β存在一个很重要的问题，就是由于不含有糖基，分子具有很强的疏水性，使其在水中的溶解度降低。为解决这一问题，在纯化过程中需引入一定量的表面活性剂（如0.1%SDS）。SDS是一种强阴离子去垢剂，对多种细胞膜蛋白及疏水蛋白具有很好的溶解效果，已用于多种重组蛋白质包涵体的溶解，但SDS对许多蛋白的构象可产生不可逆的破坏作用导致活性丧失。IFN-β与其它蛋白质不同，被SDS溶解后，活性未见明显降低，其在体外的稳定性反而增加。加入SDS后重组人干扰素β-1b可以很好地溶解，溶解度在1～5mg/ml，有利于纯化过程中的操作。通常在中性环境下，SDS会与蛋白结合，SDS会影响内毒素western blot等质检方法的检测，并有一定的毒性，影响制剂品质，而干扰素具有较强的疏水性，脱离SDS助溶环境后，会沉淀析出。如何有效去除所引入的表面活性剂，同时又要保证干扰素冻干制剂活性不变，成为一项重要的技术问题。

应用吖啶橙分光光度法来检测原液和成品中的十二烷基硫酸(sodium dodecyl sulfate,SDS)残留量：吖啶橙可以与SDS定量结合，形成橙色的SDS-吖啶橙复合物，该复合物可以用有机溶剂如甲苯从水溶液中抽提出来，可以据此计算水溶液中SDS的含量。

干扰素制剂在临床上具有广泛的应用前景，但是在实际生产中，液体制剂的干扰素制剂存在热稳定性差、不宜长时间保存和远距离运输等问题，而冻干后则可解决一些问题并具有一定的优势，所以干扰素冻干制剂越来越受青睐。常见的蛋白质药物干燥技术有冷冻干燥、喷雾干燥、喷雾-冷冻干燥、超临界干燥等。干扰素对热比较敏感，常用真空冷冻干燥方法干燥。

美国专利US6994847公开了一种IFN-β制剂，其中除含有人血白蛋白外，还含有甘露醇可以作为稳定剂，能够增加干扰素的结合力，但同时增加了该制剂的添加成分，增加了不良反应风险。

中国专利CN200580025725.5公开了一种干扰素液体制剂，该专利发明制剂在2-8℃储存条件下能够保存12-24个月，但是干扰素活性会有部分丧失。