[发明专利]微流体细胞处理芯片及其应用方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种微流体细胞处理芯片，具体说，是涉及一种以对细胞损伤小，操作简便显著，在低温保护剂的加载和去除过程中，能使低温保护剂浓度连续改变的微流体芯片及其应用方法。

背景技术

    细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。而且适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用。细胞冻存时向培养基中加入保护剂--终浓度5％~15％的甘油或二甲基亚砜(DMSO)，可使溶液冰点降低，加之在缓慢冻结条件下，细胞内水分透出，减少了冰晶形成，从而避免细胞损伤。

    卵母细胞作为一种体积较大的动物生殖细胞，它的低温保存技术是人类辅助生殖领域的重要工具。通过对健康的卵母细胞进行低温保存，将能够为需要的人提供更多的生育机会。在低温保存过程中不可避免的要使用低温保护剂，低温保护剂的使用也会带来许多副作用：一方面低温保护剂添加和去除过程中，由于渗透压的急剧变化，大量水或低温保护剂快速流出或流入细胞，从而引起细胞体积的膨胀或收缩，造成细胞膜结构和细胞骨架系统的损伤；另一方面低温保护剂对细胞有化学毒性损伤，并且其毒性大小随作用时间和作用浓度的增加而增大。目前通常采用分步添加和分步去除保护剂的方法。这种方法操作步骤繁琐，要求在很短的时间内在显微镜下准确找到细胞，并完成细胞在溶液间的转移，非常容易造成细胞的丢失，对操作人员的熟练程度要求很高；而且分步添加和分步去除的次数也不可能增加太多，这就使卵母细胞仍然会受到几次由于保护剂浓度突然变化造成的体积突然变化，且在高浓度低温保护剂中的暴露时间长。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的之一是提供一种使低温保护剂浓度连续变化的微流体细胞处理芯片。

本发明的目的之二是提供一种将微流体细胞处理芯片在卵母细胞低温保护剂加载和去除中的应用方法。

本发明的技术方案：一种微流体细胞处理芯片，由底层和顶层构成，其特点是：顶层中设有蛇形管道和细胞操作腔、蛇形管道的溶液流入口上设有两个流入通道，两个流入通道的入口管道上分别设有保护剂入口和缓冲溶液入口，蛇形管道的溶液流出通道连接细胞操作腔，细胞操作腔设有溶液出口和细胞进出口通道，细胞进出口通道上装有转矩控制微阀，细胞操作腔的两侧各设有一个半隔断。

保护剂入口和缓冲溶液入口对称于蛇形管道的溶液流入口，保护剂入口和缓冲溶液入口的开口直径相同；并且分别通过第一微流体芯片毛细管与一个双通道注射泵的两个注射器连接；入口管道的径高比为1:4~1:5。。

细胞操作腔为上凹的长方体，其容积为0.1~0.2mm3。

溶液出口连接第三微流体芯片毛细管，微流体芯片毛细管上设有溶液出口开关。 

蛇形管道的横截面为正方形，其边长d=0.05~0.2mm，相邻管道间距=0.2~0.3mm，蛇形管道的总长度为1.5~2.5cm。

半隔断为凸形扁平长方体，其与底层的间隙高度为30~40μm。

底层材质为玻璃基片，顶层材质为聚二甲基硅氧烷；细胞进出口通道上面设有半径4mm，深2mm的聚氨酯层，该聚氨酯层面积为所述顶层面积的0.3%~0.5%，聚氨酯层中间连接转矩控制微阀。

由底层和顶层构成的所述芯片的长：宽：高=60~80：45~55：1~3。 

一种微流体细胞处理芯片的应用方法，包括低温保护剂加载方法和低温保护剂去除的方法：

低温保护剂加载方法的步骤为：

a) 打开转矩控制微阀和溶液出口开关，用移液器将细胞及缓冲溶液注入与细胞进出通道入口连接的第二微流体芯片毛细管，将一注射器连接第二微流体芯片毛细管，推动注射器使得细胞进入细胞操作腔；

b) 关闭转矩控制微阀，打开双通道注射泵中的低温保护剂注射器和缓冲溶液注射器，缓慢增加低温保护剂的流速，缓慢减小缓冲溶液的流速，使得混合后的溶液中低温保护剂的浓度连续增加； 

c) 在对细胞低温保护剂加载的同时，用显微镜观察细胞体积的变化；

d) 当细胞达到处理要求后，关闭两个注射器，打开转矩控制微阀，关闭溶液出口开关；

e) 打开低温保护剂注射器，使得细胞从细胞操作腔经细胞进出通道冲出芯片，加载过程完毕。

低温保护剂去除的方法步骤为：