[发明专利]一种鸡新城疫二联体疫苗及其制备方法

说明书

技术领域

 本发明属于动物疫苗制备技术领域，具体涉及一种以HN蛋白和鸡α干扰素（α-IFN）为有效成分的二联体疫苗及其制备方法。

背景技术

家禽养殖过程中，随着病原菌新菌株、变异株的不断出现，原来对某些畜禽疫病具有较好防治效果的药物已逐渐难以达到较为满意的治疗效果。近年来，随着家禽养殖过程中病毒性疾病危害的日益严重，我国在疾病预防控制的疫苗产品制备方面投入了巨大的人力、物力和财力，对控制疾病的大规模流行扩散起到了关键的预防作用。

鸡新城疫（Newcastle disease，ND）疾病是一种由新城疫病毒引起的一种高度接触性、急性败血性传染病，是目前危害养禽业发展最为严重的传染病之一，因此又被称亚洲鸡瘟或伪鸡瘟。目前对鸡新城疫病主要以早期注射疫苗预防为主。

HN蛋白是鸡新城疫病毒的主要结构蛋白，具有良好的免疫原性和反应原性，已被用于制备鸡新城疫疾病预防的亚单位疫苗。鸡α干扰素既具有抗病毒活性又具有免疫调节和疫苗佐剂的作用，在鸡新城疫疾病的预防和治疗过程中用途较为广泛。

现有技术中，单独利用HN蛋白制备预防鸡新城疫疾病的亚单位疫苗已有较多研究，利用鸡α干扰素（α-IFN）作为疫苗来提高鸡免疫力或预防治疗疾病也有很多报道，但尚未见到将两者进行结合共同制备预防鸡新城疫疾病的疫苗的相关报道。

发明内容

本发明目的在于通过基因工程手段将HN基因和鸡α干扰素基因共同转化入真核系统进行表达，将表达获得的目的蛋白用于制备预防鸡新城疫疾病的二联体疫苗。

一种预防鸡新城疫疾病的二联体疫苗，通过以下方法制得： 

（1）利用PCR技术扩增鸡α干扰素基因，利用RT-PCR技术扩增鸡新城疫病毒HN基因；

（2）将步骤（1）获得的HN基因和鸡α干扰素基因克隆到真核表达载体质粒pcDNA3.1中，构建重组真核双表达载体质粒pcDNA3.1-IFN-HN；

（3）将步骤（2）获得的重组真核双表达载体质粒pcDNA3.1-IFN-HN转染BHK-21细胞进行ZeocinTM抗性筛选；  

（4）将步骤（3）筛选所得阳性细胞进行培养，使HN基因和鸡α干扰素基因得到充分表达；

（5）将步骤（4）HN基因和鸡α干扰素基因所表达蛋白回收纯化获得目的蛋白；

（6）将步骤（5）所获得的目的蛋白与佐剂混合制备预防鸡新城疫疾病的二联体疫苗。

所述预防鸡新城疫疾病的二联体疫苗，步骤（6）中所述目的蛋白与佐剂壳聚糖的质量比为1：1。

所述预防鸡新城疫疾病的二联体疫苗的制备方法，包括以下步骤：

（1）利用PCR技术扩增鸡α干扰素基因，利用RT-PCR技术扩增鸡新城疫病毒HN基因；

（2）将步骤（1）获得的HN基因和鸡α干扰素基因克隆到真核表达载体质粒pcDNA3.1中，构建重组真核双表达载体质粒pcDNA3.1-IFN-HN；

（3）将步骤（2）获得的重组真核双表达载体质粒pcDNA3.1-IFN-HN转染BHK-21细胞进行ZeocinTM抗性筛选；  

（4）将步骤（3）筛选所得阳性细胞进行培养，使HN基因和鸡α干扰素基因得到充分表达；

（5）将步骤（4）HN基因和鸡α干扰素基因所表达蛋白回收纯化获得目的蛋白；

（6）将步骤（5）所获得的目的蛋白与佐剂混合制备预防鸡新城疫疾病的二联体疫苗。

步骤（6）中所述目的蛋白与佐剂壳聚糖的质量比为1：1。

目前许多药物对某些畜禽疫病已经难以显示满意的防治效果，尤其是病毒性疾病的危害日益严重，因此迫切需要找到一种有效的防治方法。干扰素（IFN）作为一组具有多种功能的活性蛋白质，在具有广谱性的抗病毒作用的同时，还影响细胞的生长，以及分化、免疫功能调节的多种功能的发挥，因此在疫苗制备技术领域具有较为广泛的用途。传统的动物干扰素因其直接生产成本高、产品质量难控制、种间差异大和干扰素在动物体内不能长期稳定存在等原因，其应用范围较为有限，而利用基因工程技术制备的重组干扰素，因其制备纯度和效率远高于传统技术，因此具有较大的市场潜力和竞争力。