[发明专利]检测人XPD基因热点突变位点的方法、引物和试剂盒

说明书

 

技术领域

本发明属生命科学和生物技术领域，特别涉及用于检测人着色性干皮病D组 (xeroderma pigmentosum group D，XPD) 基因热点突变位点（Lys751Gln）的方法、引物和试剂盒，能够对XPD基因突变位点进行检测，特异性好，准确度高，可提高突变检出率。

 

背景技术

人着色性干皮病D组 (xeroderma pigmentosum group D，XPD)基因又称切除修复交叉互补基因(excision repair cross-complementing group2，ERCC2)，位于第19号染色体长臂q1313，有23个外显子，在核苷酸剪切修复过程中负责松解受损DNA 双螺旋；且参与基因转录过程, 是RNA 聚合酶Ⅱ介导转录过程中不可缺少的组成部分。XPD能打开损伤部位的DNA双链，为后续的切除和修复过程提供必要的条件。因而它可识别与修复基因结构无关的大范围损伤，清除体内多种DNA损伤。

目前已在XPD基因的编码区上发现8个单核苷酸多态性(SNP)位点(4个同义，4个为非同义)，而大部分研究集中在第751密码子的Lys751Gln这个多态性位点。XPD基因第751密码子A→C突变导致Lys751 →Gln751 氨基酸替代，大量的研究认为与Lys/ Lys 基因型相比，携带Lys/ Gln 或Gln / Gln基因型可显著降低染色单体型畸变的修复能力。而且不同的种族人群中，这个位点的等位基因频率有很大的差异，如第751密码子Gln/Gln纯合子发生频率在非洲裔美国人为6.9%，而在亚洲人群和高加索人群中分别为1.1%和13.4%。可见人类不同种群的遗传背景是有明显差异的。

随着检测技术和检测结果评价的规范化，可以通过检测外周血DNA修复基因XPD第751密码子单核甘酸多态性初步预测不同癌患者对化疗药物的敏感度，从而实现个体化治疗。

目前针对XPD基因热点突变位点的检测普遍采用的是聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)法，用PCR扩增目的DNA，扩增产物再用特异性内切酶消化切割成不同大小片段，直接在凝胶电泳上分辨。不同等位基因的限制性酶切位点分布不同，产生不同长度的DNA片段条带。该方法简便，结果容易判定，但是也同时存在诸多弊端，①靶片段的扩增产物要纯，如有非特异产物（特别是大片段可能含有酶识别序列）将竞争酶活性，使样品消化不完全或及出现酶消化杂带；②酶消化过程要充分（即底物与酶的比例要合适，消化时间要保证），避免假阴性结果；③酶切阳性结果可以确定所检测具体序列，阴性结果仅可说明非酶识别序列，但不能准确判定具体序列。④酶识别序列如有甲基化之核苷酸将不被切割。

 

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供用快速，准确，高通量地检测XPD基因热点突变（Lys751Gln）的方法、引物和试剂盒。

本发明提供用于检测检测人XPD基因热点突变位点的引物，所述引物包括：

(1)一对用于扩增人XPD基因第23外显子的特异性外侧引物SEQ NO1和SEQ NO2，其碱基序列为：

SEQ NO1：TCTGGATTATACGGACATCTC；

SEQ NO2：Biotin-TCACCTGACTTCATAAGACCT

(2) 一条特异性内侧测序引物SEQ NO3，其碱基序列为：

SEQ NO3：GCTAGAATCAGAGGAGACG.。

进一步地，所述突变位点为Lys751Gln。

本发明还提供一种用于检测检测人XPD基因热点突变位点的方法，所述方法包括：

（i）提取样品中的DNA；

（ii）利用一对特异性外侧扩增引物SEQ NO1和SEQ NO 2，进行PCR扩增，获得扩增产物，其中SEQ NO1：TCTGGATTATACGGACATCTC；SEQ NO2：Biotin-TCACCTGACTTCATAAGACCT；

（iii）将（ii）中的扩增产物进行电泳鉴定，确定是否扩增成功；

（iv）若扩增成功，利用一条特异性内侧测序引物SEQ NO3对所述扩增产物进行焦磷酸测序，获得所述扩增产物的基因序列，其中 SEQ NO3：GCTAGAATCAGAGGAGACG.；

（v）将所述基因序列与人XPD基因第23外显子野生型基因序列进行比对，判断是否存在热点突变位点。